吸光光度法一般僅適用于微量組分的測定，當(dāng)待測定組分濃度過高或過低，亦即吸光度測量值過大或過小時，從上節(jié)的測量誤差的討論得知，在這種情況下即使沒有偏離朗伯—比耳定律的現(xiàn)象，也會有很大的測量誤差，導(dǎo)致準(zhǔn)確度大為降低。采用示差法可克服這一缺點。目前主要有高濃度示差法，稀溶液示差法和使用兩個參比溶液的精密示差法。其中以高濃度示差法應(yīng)用*多，本節(jié)將著重討論。

示差光度法和一般的光度法不同之處主要在于，示差法不是以空白溶液（不含待測組分的溶液）作為參比溶液，而是采用比待測溶液濃度稍低的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液，然后測量待測溶液的吸光度，再從測得的吸光度求出它的濃度。這樣便大大提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

設(shè)用作參比的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為c_s，待測溶液濃度為c_x，且c_x>c_s，根據(jù)朗伯—比耳定律得到

兩式相減：

                                   =εb（c_x-c_s）=εbΔc                  （2-12）

實際操作是：用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比，調(diào)節(jié)其吸光度為零（透光率100%），然后測量待測溶液的吸光度。這時測得的吸光度實際是這兩種溶液吸光度的差值（相對吸光度）。從（2-12）式可知，所測得的吸光度差值與這兩種溶液的濃度差成正比。這樣便可以把空白溶液為參比的稀溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線作為ΔA對應(yīng)于Δc的工作曲線，根據(jù)測得的ΔA找出相應(yīng)的Δc值，從c_x=c_s+Δc，便可求出待測溶液之濃度，這就是示差法定量測定的基本原理。

用示差法測定濃度過高或過低試液，其準(zhǔn)確度比一般分光光度法高。這可從圖2-3看出。設(shè)

圖2-3 示差法標(biāo)尺原理

按一般分光光度法用試劑空白作參比溶液，測得溶液的透光率T_x=6%，顯然，這時的測量讀數(shù)誤差是很大的。采用示差法時，如果按一般分光光度法測得的Ts=10%的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液，使其透光率從標(biāo)尺上Ts₁=10%處調(diào)至Ts₂=100%處，相當(dāng)于把檢流計上的標(biāo)尺擴展到原來的十倍（T_S2/T_S1=100/10=10），這樣待測試液透光率原來為6%，讀數(shù)落在光度計標(biāo)尺刻度很密，測量誤差很大的區(qū)域，改用示差法測定時，透光率則是60%，讀數(shù)落在測量誤差很小的區(qū)域，從而提高了測定的準(zhǔn)確度。計算出來的c_x當(dāng)然比較準(zhǔn)確了。示差光度法測定的Δc即使很小，如果測量誤差為dc，雖然dc/Δc可能會很大，但*后測定的結(jié)果之相對誤差是dc/（c_x+Δc），而c_x相對于Δc而言是個相當(dāng)大的值，且十分準(zhǔn)確，因此相對誤差就大為降低，導(dǎo)致*后測定結(jié)果的準(zhǔn)確度必然提高。所以示差分光光度法可以準(zhǔn)確測定高濃度的試液，同樣示差分光光度法也可以用來測定低濃度的試液，水汽分析中用來測定微量硅的儀器——小硅表就是利用示差法設(shè)計的。