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微生物的培養(yǎng)基
日期：2025-02-09 00:40
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摘要：
培養(yǎng)基（medium）是人工配制的,適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質。無論是以微生物為材料的研究,還是利用微生物生產(chǎn)生物制品,都必須進行培養(yǎng)基的配制，它是微生物學研究和微生物發(fā)酵工業(yè)的基礎。
一、配制培養(yǎng)基的原則
1. 選擇適宜的營養(yǎng)物質
總體而言,所有微生物生長繁殖均需要培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水及能源,但由于微生物營養(yǎng)類型復雜,不同微生物對營養(yǎng)物質的需**不一樣的,因此首先要根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需求配制針對性強的培養(yǎng)基。自養(yǎng)型微生物能從簡單的無機物合成自身需要的糖、脂類、蛋白質、核酸、維生素等復雜的有機物,因此培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以(或應該)由簡單的無機物組成。例如,培養(yǎng)化能自養(yǎng)型的氧化硫硫桿菌(Thiobacillus thiooxidans)的培養(yǎng)基組成（見表6-9）。在該培養(yǎng)基配制過程中并未專門加入其它碳源物質,而是依靠空氣中和溶于水中的CO2為氧化硫硫桿菌提供碳源。
培養(yǎng)其它化能自養(yǎng)型微生物與上述培養(yǎng)基成分基本類似,只是能源物質有所改變。對光能自養(yǎng)型微生物而言,除需要各類營養(yǎng)物質外,還需光照提供能源。培養(yǎng)異養(yǎng)型微生物需要在培養(yǎng)基中添加有機物,而且不同類型異養(yǎng)型微生物的營養(yǎng)要求差別很大,因此其培養(yǎng)基組成也相差很遠。例如,培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基組成比較簡單(表6-9),而有些異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的成份非常復雜,如腸膜明串珠菌需要生長因子,若配制培養(yǎng)它的合成培養(yǎng)基時,需要在培養(yǎng)基中添加的生長因子多達33種,因此通常采用天然有機物來為它提供生長所需的生長因子。
就微生物主要類型而言,有**、放線菌、酵母菌、霉菌、原生動物、藻類及病毒之分,培養(yǎng)它們所需的培養(yǎng)基各不相同。在實驗室中常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）培養(yǎng)**(表6-9);用高氏1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌(表6-9);培養(yǎng)酵母菌一般用麥芽汁培養(yǎng)基,它是將麥芽粉與4倍水混勻,在58～65℃條件下保溫3～4小時至完全糖化,調整糖液濃度為10о巴林, 煮沸后用紗布過濾,調pH為6.0配制而成。麥芽粉組成復雜,能為酵母菌提供足夠的營養(yǎng)物質;培養(yǎng)霉菌則一般用查氏合成培養(yǎng)基(表6-9)。
2. 營養(yǎng)物質濃度及配比合適
培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質濃度合適時微生物才能生長良好,營養(yǎng)物質濃度過低時不能滿足微生物正常生長所需,濃度過高時則可能對微生物生長起抑制作用,例如高濃度糖類物質、無機鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進微生物的生長,反而起到抑制或**作用。另外，培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質之間的濃度配比也直接影響微生物的生長繁殖和(或)代謝產(chǎn)物的形成和積累,其中碳氮比(C/N)的影響較大。嚴格地講，碳氮比指培養(yǎng)基中碳元素與氮元素的摩爾數(shù)比值,有時也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白之比。例如，在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的過程中,培養(yǎng)基碳氮比為4/1時,菌體大量繁殖,谷氨酸積累少;當培養(yǎng)基碳氮比為3/1時,菌體繁殖受到抑制,谷氨酸產(chǎn)量則大量增加。再如,在***發(fā)酵生產(chǎn)過程中,可以通過控制培養(yǎng)基中速效氮(或碳)源與遲效氮(或碳)源之間的比例來控制菌體生長與***的合成。
3. 控制pH條件
培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內,以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。各類微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的*適pH條件各不相同,一般來講,**與放線菌適于在pH7～7.5范圍內生長,酵母菌和霉菌通常在pH4.5～6范圍內生長。值得注意的是,在微生物生長繁殖和代謝過程中,由于營養(yǎng)物質被分解利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累,會導致培養(yǎng)基pH發(fā)生變化,若不對培養(yǎng)基pH條件進行控制,往往導致微生物生長速度和代謝產(chǎn)物產(chǎn)量降低。因此,為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定,通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑,常用的緩沖劑是一氫和二氫磷酸鹽(如K2HPO4和KH2PO4)組成的混合物。K2HPO4溶液呈堿性,KH2PO4溶液呈酸性,兩種物質的等克分子混合溶液的pH值為6.8。當培養(yǎng)基中酸性物質積累導致H+濃度增加時,H+與弱堿性鹽結合形成弱酸性化合物,培養(yǎng)基pH不會過度降低;如果培養(yǎng)基中OH-濃度增加,OH-則與弱酸性鹽結合形成弱堿性化合物,培養(yǎng)基pH也不會過度升高。
但K2HPO4/KH2PO4緩沖系統(tǒng)只能在一定的pH范圍（pH6.4～7.2）內起調節(jié)作用。有些微生物，如乳酸菌能大量產(chǎn)酸,上述緩沖系統(tǒng)就難以起到緩沖作用,此時可在培養(yǎng)基中添加難溶的碳酸鹽(如CaCO3)來進行調節(jié),CaCO3難溶于水,不會使培養(yǎng)基pH過度升高,但它可以不斷中和微生物產(chǎn)生的酸,同時釋放出CO2,將培養(yǎng)基pH控制在一定范圍內。
在培養(yǎng)基中還存在一些天然的緩沖系統(tǒng),如氨基酸、肽、蛋白質都屬于兩性電解質,也可起到緩沖劑的作用。 4. 控制氧化還原電位(redox potential)
不同類型微生物生長對氧化還原電位(Ф)的要求不一樣,一般好氧性微生物在Ф值為+0.1伏以上時可正常生長,一般以+0.3～+0.4伏為宜；厭氧性微生物只能在Ф值低于+0.1伏條件下生長；兼性厭氧微生物在Ф值為+0.1伏以上時進行好氧呼吸,在+0.1伏以下時進行發(fā)酵。Ф值與氧分壓和pH有關,也受某些微生物代謝產(chǎn)物的影響。在pH相對穩(wěn)定的條件下,可通過增加通氣量(如振蕩培養(yǎng)、攪拌)提高培養(yǎng)基的氧分壓,或加入氧化劑,從而增加Ф值;在培養(yǎng)基中加入抗壞血酸、硫化氫、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等還原性物質可降低Ф值。
5. 原料來源的選擇
在配制培養(yǎng)基時應盡量利用廉價且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成分,特別是在發(fā)酵工業(yè)中,培養(yǎng)基用量很大,利用低成本的原料更體現(xiàn)出其經(jīng)濟價值。例如，在微生物單細胞蛋白的工業(yè)生產(chǎn)過程中,常常利用糖蜜(制糖工業(yè)中含有蔗糖的廢液)、乳清(乳制品工業(yè)中含有乳糖的廢液)、豆制品工業(yè)廢液及黑廢液(造紙工業(yè)中含有戊糖和己糖的亞硫酸紙漿)等都可作為培養(yǎng)基的原料。再如,工業(yè)上的甲烷發(fā)酵主要利用廢水、廢渣作原料,而在我國農(nóng)村，已推廣利用人畜糞便及禾草為原料發(fā)酵生產(chǎn)甲烷作為燃料。另外,大量的農(nóng)副產(chǎn)品，如麩皮、米糠、玉米漿、酵母浸膏、酒糟、豆餅、花生餅、蛋白胨等都是常用的發(fā)酵工業(yè)原料。
6. **處理
要獲得微生物純培養(yǎng)，必須避免雜菌污染，因此應對所用器材及工作場所進行**與**。對培養(yǎng)基而言，更是要進行嚴格的**。對培養(yǎng)基一般采取高壓蒸汽**，一般培養(yǎng)基用1.05kg/cm2,121.3℃15-30分鐘可達到**目的。在高壓蒸汽**過程中，長時間高溫會使某些不耐熱物質遭到破壞，如使糖類物質形成氨基糖、焦糖，因此含糖培養(yǎng)基常用0.56kg/cm2,112.6℃15-30分鐘進行**，對某些對糖要求較高的培養(yǎng)基，可先將糖進行過濾**或間歇**，再與其它已**的成份混合；長時間高溫還會引起磷酸鹽、碳酸鹽與某些陽離子(特別是鈣、鎂、鐵離子)結合形成難溶性復合物而產(chǎn)生沉淀，因此,在配制用于觀察和定量測定微生物生長狀況的合成培養(yǎng)基時,常需在培養(yǎng)基中加入少量螯合劑,避免培養(yǎng)基中產(chǎn)生沉淀而影響OD值的測定,常用的螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)。還可以將含鈣、鎂、鐵等離子的成份與磷酸鹽、碳酸鹽分別進行**，然后再混合，避免形成沉淀；高壓蒸汽**后，培養(yǎng)基pH會發(fā)生改變（一般使pH降低），可根據(jù)所培養(yǎng)微生物的要求，在培養(yǎng)基**前后加以調整。在配制培養(yǎng)基過程中,泡沫的存在對**處理極為不利,因為泡沫中的空氣形成隔熱層,使泡沫中微生物難以被殺死。因而有時需要在培養(yǎng)基中加入消泡劑以減少泡沫的產(chǎn)生，或適當提高**溫度，延長**時間。
二、培養(yǎng)基的類型及應用
1．按照營養(yǎng)成分劃分
天然培養(yǎng)基。指利用天然的有機物配制而成的培養(yǎng)基。例如牛肉膏、麥芽汁，豆芽汁、麥曲汁，馬鈴薯，玉米粉，麩皮，花生餅粉等制成的培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基的特點是配制方便、營養(yǎng)**而豐富、價格低廉，適合于各類異養(yǎng)微生物生長，并適于大規(guī)模培養(yǎng)微生物之用。缺點是它們的成分復雜，不同單位生產(chǎn)的或同一單位不同批次所提供的產(chǎn)品成分也不穩(wěn)定，一般自養(yǎng)型微生物卻不能在這類培養(yǎng)基上生長。
合成培養(yǎng)基。是由化學成分完全了解的物質配制而成的培養(yǎng)基，也稱化學限定培養(yǎng)基。如高氏1號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基就屬于此種類型。此類培養(yǎng)基優(yōu)點是成分**、重復性較強，一般用于實驗室進行營養(yǎng)代謝、分類鑒定和菌種選育等工作。缺點是配制料復雜，微生物在此類培養(yǎng)基上生長緩慢，成本較高，不適宜用于大規(guī)模的生產(chǎn)。
半合成培養(yǎng)基。用一部分天然的有機物作為碳源、氮源及生長素等物質，并適當補充無機鹽類，這樣配制的培養(yǎng)基稱為半合成培養(yǎng)基。如實驗室中使用的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基屬于半合成培養(yǎng)基。此類培養(yǎng)基用途*廣，大多數(shù)微生物都在此類培養(yǎng)基上生長。
2．按照物理狀態(tài)來劃分
液體培養(yǎng)基。把各種營養(yǎng)物質溶于水中，混合制成水溶液，調節(jié)適當?shù)?/span>pH，成為液體狀的培養(yǎng)基質。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物時，通過攪拌可以增加培養(yǎng)基的通氣量，同時使營養(yǎng)物質分布均勻，有利于微生物的生長和積累代謝產(chǎn)物。常用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和實驗室觀察微生物生長特征及應用方面的研究。
固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，如瓊脂（1.5%～2.0%）、明膠等煮沸冷卻后，使其凝成固體狀態(tài)。常作為觀察、鑒定、活菌計數(shù)和分離純化微生物的培養(yǎng)基。
半固體培養(yǎng)基。加入少量的凝固劑（0.5%～0.8%的瓊脂）則成半固體狀的培養(yǎng)基。常用來觀察微生物的運動特征、分類鑒定及噬菌體效價滴定等。
3．按照用途劃分
基礎培養(yǎng)基。盡管不同微生物的營養(yǎng)需求各不相同,但大多數(shù)微生物所需的基本營養(yǎng)物質是相同的?；A培養(yǎng)基是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是*常用的基礎培養(yǎng)基?；A培養(yǎng)基也可以作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分,再根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)需求,在基礎培養(yǎng)基中加入所需營養(yǎng)物質。
增殖培養(yǎng)基 (加富培養(yǎng)基)。根據(jù)某種微生物的生長要求，加入有利于這種微生物生長繁殖而不適合其它微生物生長的營養(yǎng)物質配制的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基稱為增殖培養(yǎng)基或稱為加富培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基常用于菌種分離篩選。
鑒別培養(yǎng)基。根據(jù)微生物代謝特點通過指示劑的顯色反應以鑒定不同種類的微生物的培養(yǎng)基，稱為鑒別培養(yǎng)基。
選擇培養(yǎng)基。是用來將某種微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基。根據(jù)不同種類微生物的特殊營養(yǎng)要求或對某種化學物質的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入特殊的營養(yǎng)物質或化學物質以抑制不需要微生物的生長，而促進某種需要菌的生長，這類培養(yǎng)基叫選擇培養(yǎng)基。
三、培養(yǎng)基的配置過程
（一）配置前的準備
1. 查閱相關資料，檢查配方。
2. 檢查材料、用水、設備
3. 配置方法的選擇：
營養(yǎng)物質的溶解方法
酸堿度的調整方法
**方法
