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抗（抑）菌試驗(yàn)
日期：2025-02-08 17:00
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摘要：
抗（抑）菌試驗(yàn)
2.1.8.1 目的
測(cè)定抗（抑）菌產(chǎn)品對(duì)**和**的抗（抑）菌作用。
常使用的方法有抑菌環(huán)試驗(yàn)、*小抑制濃度測(cè)定試驗(yàn)、滯 留 抑 菌 效 果 測(cè) 定 試 驗(yàn)、洗衣粉**效果測(cè)定試驗(yàn)、振蕩燒瓶試驗(yàn)、浸漬試驗(yàn)與奎因試驗(yàn)，可視情況選用。
2.1.8.2 抑菌環(huán)試驗(yàn)
2.1.8.2.1 原理
利用抑菌劑不斷溶解經(jīng)瓊脂擴(kuò)散形成不同濃度梯度，以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)通過(guò)抑菌環(huán)大小以判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于抑菌劑與溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的鑒定。
2.1.8.2.2 試驗(yàn)器材
(1)金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大腸桿菌(8099)、白色*** (ATCC 10231) 菌懸液(見(jiàn)2.1.1.2)及根據(jù)抑菌劑特定用途所用的其他菌懸液。
(2)抑菌劑載體 (5 mm 直徑園形新華一號(hào)定性濾紙片，經(jīng)壓力蒸汽**處理后，置 120℃ 烤干2h，保存?zhèn)溆?。
(3)活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所需器材(見(jiàn)2.1.1.3)。
(4)微量移液器(5μl～50μl，可調(diào)式)。
(5)游標(biāo)卡尺。
(6)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基與沙堡瓊脂培養(yǎng)基
2.1.8.2.3 操作程序
(1)抑菌片的制備:對(duì)液體抑菌劑，取無(wú)菌并干燥的濾紙片。每片滴加實(shí)際使用濃度抑菌劑溶液20μl，然后將濾紙片平放于清潔的無(wú)菌平皿內(nèi)，開(kāi)蓋置溫箱(37℃) 中烤干，或置室溫下自然干燥后備用。
溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品，可直接制成直徑為 5mm，厚不超過(guò) 4mm圓片(塊)，每 4 片(塊) 一組。
(2)陰性對(duì)照樣片的制備:取無(wú)菌干燥濾紙片，每片滴加無(wú)菌蒸餾水 20μl，干燥后備用。
溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的陰性對(duì)照樣本，應(yīng)取同種材質(zhì)不含抑菌成份的樣品，制成與試驗(yàn)組大小相同的樣片(塊)。
(3)試驗(yàn)菌的接種:用無(wú)菌棉拭子蘸取濃度為 5×105cfu/ml～5×106cfu/ml試驗(yàn)菌懸液，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面均勻涂抹3次。每涂抹1次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng) 60°，*后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿，置室溫干燥5min。
(4)抑菌劑樣片貼放:每次試驗(yàn)貼放1個(gè)染菌平板，每個(gè)平板貼放4片試驗(yàn)樣片，1 片陰性對(duì)照樣片，共 5片。用無(wú)菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各樣片中心之間相距 25mm以上，與平板的周緣相距 15mm以上。貼放好后，用無(wú)菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置37℃溫箱，培養(yǎng)16h～18h觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑 (包括貼片) 并記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。
測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)，應(yīng)選均勻而完全無(wú)菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)行。 測(cè)量其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界。
2.1.8.2.4 評(píng)價(jià)規(guī)定
(1)抑菌作用的判斷:
抑菌環(huán)直徑大于 7mm 者，判為有抑菌作用。
抑菌環(huán)直徑小于或等于 7mm 者，判為無(wú)抑菌作用。
(2) 3 次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格。
(3)陰性對(duì)照組應(yīng)無(wú)抑菌環(huán)產(chǎn)生。否則試驗(yàn)無(wú)效。
2.1.8.2.5 注意事項(xiàng)
(1)每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照，不可省略。在報(bào)告中亦必須將對(duì)照組的結(jié)果列出。
(2)接種用**懸液的濃度應(yīng)符合要求。濃度過(guò)低，接種菌量少，抑菌環(huán)常因之增大; 濃度過(guò)高，接種量過(guò)多，抑菌環(huán)則可減小。
(3)應(yīng)保持瓊脂濃度的準(zhǔn)確性，否則可影響抑菌環(huán)的大小。
(4)培養(yǎng)時(shí)間不得超過(guò) 18h。培養(yǎng)過(guò)久，部分**可恢復(fù)生長(zhǎng)，抑菌環(huán)變小。
(5)抑菌環(huán)直徑可受抑菌劑的量、抑菌性能和干濕度影響。故抑菌劑濾紙片應(yīng)在試驗(yàn)當(dāng)天制備。
2.1.8.3 *小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)（瓊脂稀釋法）
2.1.8.3.1原理
本試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法將不同濃度的抑菌劑混合溶解在瓊脂培養(yǎng)基中，然后點(diǎn)種**，通過(guò)**的生長(zhǎng)與否，確定抗（抑）菌物質(zhì)抑制受試菌生長(zhǎng)的*低濃度，即*小抑菌濃度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)。本方法適用于不溶性抗（抑）菌產(chǎn)品。
2.1.8.3.2 試驗(yàn)器材
（1）菌株
金黃色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大腸桿菌 8099或ATCC 11229。
可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株。
（2）水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MH），稱(chēng)取38gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中，加熱至沸騰溶解，然后121℃高壓**15min，置45℃～50℃水浴備用，此培養(yǎng)基將用于對(duì)照試驗(yàn)。
（3）0.03mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.2。
（4）加樣器（1μl～10μl）。
（5）45℃～50℃水浴恒溫箱。
（6）吸管、試管、平皿。
（7）37℃培養(yǎng)箱。
2.1.8.3.3 操作步驟
（1）抗（抑）菌溶液的配制：以無(wú)菌操作取5ml或5g（固體研磨后）樣品，放入45ml**磷酸緩沖液中，充分震蕩溶解，配成10%的均勻分散的溶液或懸液。
（2）含**劑培養(yǎng)基配制：將已配成10%的抗（抑）菌溶液或懸液用PBS做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，置45℃～50℃水浴恒溫備用。
（3）雙倍濃度培養(yǎng)基配制：稱(chēng)取76gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中。加熱至沸騰溶解。然后121℃壓力蒸汽**15min，置45℃～50℃水浴備用。此培養(yǎng)基將用于稀釋抗（抑）菌溶液或懸液。
（4）含抗（抑）菌液培養(yǎng)基的配制：分別取10ml系列稀釋的**液加入平皿內(nèi)。將在45℃～50℃水浴中的雙倍MH瓊脂培養(yǎng)基10ml，加入平皿內(nèi)，邊加邊搖晃平板，使抗（抑）菌液和培養(yǎng)基充分混勻，待凝固后備用。
（5）用加樣器取1μl～2μl（含菌量約為107cfu/ml）菌懸液點(diǎn)種于含抗（抑）菌液培養(yǎng)基的平皿，接種后所形成的菌液圈直徑約5mm～8mm（每個(gè)點(diǎn)菌量約為104cfu）。
（6）以同樣方法接種不含抗（抑）菌成分的MH瓊脂平板，作為陽(yáng)性對(duì)照。
（7）將接種后的平板放置35℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果。
2.1.8.3.4 評(píng)判規(guī)定
菌落生長(zhǎng)被完全抑制的*低抗（抑）菌液濃度為該樣品對(duì)受試菌的MIC。單一菌落生長(zhǎng)可忽略不計(jì)。
2.1.8.3.5 注意事項(xiàng)
（1）接種時(shí)，應(yīng)由低抗（抑）菌劑濃度向高濃度平板依次接種，*后接種對(duì)照平板。
（2）為了保證平板受熱均勻，培養(yǎng)時(shí)平板堆放不得超過(guò)4個(gè)。
2.1.8.4 *小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)（營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋法）
2.1.8.4.1原理
本試驗(yàn)將不同濃度的抑菌劑混合溶解于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，然后接種**，通過(guò)**的生長(zhǎng)與否，確定抗（抑）菌劑抑制受試菌生長(zhǎng)的*低濃度，即*小抑菌濃度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)。本方法式用于可溶性抑菌產(chǎn)品。
2.1.8.4.2 試驗(yàn)器材
（1）試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大腸桿菌 8099或ATCC 11229。
可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株。
（2）營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，見(jiàn)附錄A。
（3）稀釋液，見(jiàn)附錄A。
（4）吸管、試管
（5）37℃培養(yǎng)箱。
2.1.8.4.3 操作步驟
（1）按 2.1.1.2 所示方法制備的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌懸液
（2）含**劑培養(yǎng)基配制：將抗（抑）菌溶液用蒸餾水做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，取各稀釋度受試液2.5ml加入到含2.5ml雙倍濃度營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中。
（3）取0.1ml含菌量約為108cfu/ml菌懸液接種于含抗（抑）菌劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為試驗(yàn)組樣本。
（4）以同樣方法接種不含抗（抑）菌劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為陽(yáng)性對(duì)照組樣本。
（5）取2支含營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為陰性對(duì)照組樣本。
（6）將試驗(yàn)組樣本、陽(yáng)性對(duì)照組樣本及陰性對(duì)照組樣本放置37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。
（7）試驗(yàn)中應(yīng)將試驗(yàn)用菌懸液進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，其作用濃度應(yīng)為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。
2.1.8.4.4 評(píng)判規(guī)定
當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照管有**生長(zhǎng)(混濁)，陰性對(duì)照管無(wú)菌生長(zhǎng)(透明)，試驗(yàn)用菌懸液的作用濃度為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml時(shí)，試驗(yàn)組無(wú)菌生長(zhǎng)的*高稀釋度所對(duì)應(yīng)的抗（抑）菌劑濃度，為該樣品對(duì)受試菌的MIC。
2.1.8.4.5 注意事項(xiàng)
接種時(shí)，應(yīng)由低抗（抑）菌劑濃度向高濃度依次接種，
2.1.8.5 滯 留 抑 菌 效果 試 驗(yàn)
2.1.8.5.1 原 理
本試驗(yàn)通過(guò)模擬適合**生長(zhǎng)、繁殖和可能產(chǎn)生感染的皮膚條件下，使用隨機(jī)性、雙盲的、配對(duì)比較的方法檢測(cè)抗（抑）菌香皂和**沐浴露12h或24h的滯留抑菌效果。
2.1.8.5.2試驗(yàn)器材
(1) 試驗(yàn)產(chǎn)品: 試驗(yàn)品為25套按順序編號(hào)的香皂樣品。每套2塊，一塊為測(cè)試樣品皂，另一塊為不含抑菌劑的對(duì)照皂。
(2) 不含抑菌劑的洗發(fā)水 25瓶（200ml/瓶）
(3) 不含抑菌劑的香皂 25塊
(4) 胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)
(5) 胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）
(6) 0.075mol/L的磷酸鹽緩沖液
(7) 70%酒精
(8) 恒溫箱
(9) 金屬筒 （直徑2.2cm、高度3cm）
(10) 一次性接種環(huán)（直徑4mm）
(11) 小塑料碗（直徑2.2cm，高2.5mm，）
(12) 膠帶（Darapore，3M公司生產(chǎn)）
(13) 尼龍刮菌棒
(14) Triton-X 100 500ml
(15) 外用***軟膏(例如:百多邦莫匹羅星軟膏)
(16) 玻璃彎棒
(17) 羊血
(18) 金黃色葡萄球菌ATCC27217（此株金黃色葡萄球菌是一種低毒性、對(duì)青霉素敏感、對(duì)四環(huán)素有抗藥性的色素株，曾用于許多試驗(yàn)研究，沒(méi)有任何嚴(yán)重副作用）。
(19) 皮膚**劑
2.1.8.5.3 試驗(yàn)步驟
(1)調(diào)整階段
試驗(yàn)開(kāi)始前7d至14d，受試者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗發(fā)水和沐浴液進(jìn)行日常的洗手、洗澡。此階段持續(xù)至少7d，但不超過(guò)14d。
(2)清洗階段
清洗階段共3d，受試者每天用抑菌皂清洗一側(cè)前臂，用對(duì)照皂清洗另一側(cè)前臂，清洗過(guò)程如下:
1）先清洗左臂，用流動(dòng)水（水溫應(yīng)保持在35℃～37℃）打濕前臂內(nèi)側(cè)；
2）用香皂從手腕至臂肘上下摩擦15s；
3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫45s；
4）用流動(dòng)的清水沖洗前臂15s，不要搓擦；
5）用紙巾沾干前臂. 不要搓擦；
6）重復(fù)以上步驟清洗右臂；
7）按上面所描述的試驗(yàn)步驟每日清洗前臂3次，每次間隔至少一個(gè)小時(shí)，在*后一次清洗之后，需記錄好時(shí)間，在12h之后，進(jìn)行滯留效果檢測(cè)。在第9次清洗前臂以后，受試者不能洗澡、淋浴或洗凈前臂，直到試驗(yàn)結(jié)束。用品包的標(biāo)簽上注明洗哪只手臂。清洗前后的兩塊香皂的重量及受試者完成清洗的情況，須記錄下來(lái)。
（3）試驗(yàn)階段
清洗階段的第四天(*后一次清洗后12h或24h)，將在受試者每只前臂上劃出一個(gè)試驗(yàn)區(qū)，對(duì)試驗(yàn)區(qū)進(jìn)行接種、封包和回收存活**，具體步驟如下:
1）將金黃色葡萄球菌（ATCC27217）連續(xù)轉(zhuǎn)種3代，取第3代培養(yǎng)物接種于胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）中，在35℃±2℃的條件下培養(yǎng)20h±2h。然后用胰蛋白酶大豆肉湯適當(dāng)稀釋菌懸液，使菌懸液濃度約為108cfu/ml～109cfu/ml。
2）**接種:在受試者的每只前臂中間部位（不要在手腕和肘皺褶處），用帶有印墨直徑為3.0cm的玻璃量筒扣在皮膚上，劃分出一個(gè)試驗(yàn)區(qū)。使用加樣器取10μl上述菌懸液，接種于前臂試驗(yàn)區(qū)（菌落數(shù)為106cfu/試驗(yàn)區(qū)～107cfu/試驗(yàn)區(qū)），用一次性接種環(huán)，把接種物涂成一圓形，使其與試驗(yàn)區(qū)邊緣應(yīng)有4mm～5mm的距離。
3）封包:**接種后立即用小塑料碗扣于染菌區(qū)上面 ，再用膠帶將小塑料碗固定在皮膚上，記錄封包的時(shí)間。
4）回收存活**：接種后2h±5min對(duì)前臂上接種的區(qū)域進(jìn)行取樣。將金屬筒放置于試驗(yàn)區(qū)中間部位，不要接觸到蓋有印墨的邊緣。將1ml含0.1%triton-X100的0.075mol/L磷酸鹽緩沖液吸移至金屬筒內(nèi)，用尼龍刮菌棒刮洗金屬筒罩住區(qū)域內(nèi)的皮膚60s，將筒內(nèi)液體吸移至試管內(nèi)，再加1ml含0.1%tritonX-100的0.075mol/L磷酸鹽緩沖液，對(duì)該區(qū)域內(nèi)的皮膚進(jìn)行第2次刮洗30s，將第2次擦洗的液體，注入含第1次刮洗液體的試管中。
5）實(shí)驗(yàn)區(qū)試驗(yàn)后的**處理:一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)采樣之后，需用70%的酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行**。然后對(duì)另一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)以同樣方法進(jìn)行采樣，采樣結(jié)束后，先用70%的酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行**，然后用皮膚**劑對(duì)兩只前臂進(jìn)行**處理，處理后清水沖洗，擦干，再涂少量的***軟膏。
6）平皿接種與培養(yǎng):對(duì)每一個(gè)取樣進(jìn)行平皿接種，以0.0375mol/L磷酸鹽緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)x適當(dāng)稀釋度取0.1ml接種于2個(gè)含5%羊血的TSA平板表面，用玻璃彎棒涂勻，在35℃±2℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±4h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。
7）抑菌率的計(jì)算
抑菌率=[ （對(duì)照平均菌落數(shù)－試驗(yàn)平均菌落數(shù)）/ 對(duì)照平均菌落數(shù)] ×100%
2.1.8.5.4 判定標(biāo)準(zhǔn)
試驗(yàn)不得少于16人次，抑菌率≥50%，可判定該產(chǎn)品在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)有滯留抑菌作用。
2.1.8.5.5注意事項(xiàng)
（1）受試者錄用標(biāo)準(zhǔn)
①年齡介于18歲至65歲的男性或女性；
②受試者應(yīng)身體健康；
③前臂應(yīng)完好無(wú)損且沒(méi)有皮膚病及其它皮膚問(wèn)題；
④同意在整個(gè)試驗(yàn)期間，避免使用抗（抑）菌洗液和乳膏、局部類(lèi)固醇類(lèi)藥和全身或局部使用***，除非因?yàn)椴l(fā)病癥醫(yī)生要求使用；
⑤同意在清洗階段使用非**香皂或洗液洗澡和淋浴，但受試者不能清洗前臂。在第9次洗完前臂以后，不洗澡，淋浴或洗凈前臂，直到試驗(yàn)結(jié)束。
（2）排除受試者的標(biāo)準(zhǔn) 如果受試者有下列情況之一，不能被錄用參加試驗(yàn)
① 同時(shí)參加另外一個(gè)臨床試驗(yàn)
② 在過(guò)去的14d中，參加過(guò)任何一種形式的關(guān)于清潔手或手臂的試驗(yàn)
③ 對(duì)香皂、去污劑、香水或青霉素過(guò)敏
④ 懷孕婦女
⑤ 診斷患有糖尿病、肝炎、艾滋?。℉IV陽(yáng)性）、器官移植者，
（3）其它試驗(yàn)限制
① 受試者不得使用其它清潔用品；
② 受試者應(yīng)避免洗熱水盆浴和游泳；
③ 受試者應(yīng)避免接觸未干的油漆、涂料或者其它溶劑；
④ 受試者應(yīng)避免在手腕處和前臂上噴灑香水。
（4）在試驗(yàn)完成后的48h～72h內(nèi)，需檢查前臂上有無(wú)小**、水皰，隆起的紅色癢皰。出現(xiàn)這些情況的受試者應(yīng)盡快通知檢驗(yàn)單位。
2.1.8.6洗衣粉抗（抑）菌效果鑒定方法8
2.1.8.6.1 原 理
本 方 法 通過(guò) 模 擬 洗 衣 機(jī) 的 洗 衣 過(guò) 程 ，檢 測(cè) 抗 （抑）菌 洗 衣 粉（劑）的 抗 菌 作 用 。
2.1.8.6.2 試 驗(yàn) 器 材
（1） 試 驗(yàn) 菌 株
大 腸 桿 菌 A T C C 1 1 2 2 9，金 黃 色 葡 萄 球 菌 A T C C 6 5 3 8。
（2）培 養(yǎng) 基
營(yíng) 養(yǎng) 瓊 脂（ 瓊 脂 含 量 為1.5%）
營(yíng)養(yǎng)瓊脂A：在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中另加入1.5 %的瓊脂。
TSA營(yíng)養(yǎng)肉湯。
（3）牛 血 清 白 蛋 白（ 過(guò) 濾 除 菌）
（4）烷 基 酚 聚 氧 乙 烯 醚 （Tergitol ）
（5）碳 酸 鈉
（6）標(biāo)準(zhǔn) 硬 水
（7）非 離 子 浸 濕 劑 ： 見(jiàn) 測(cè) 試 棉布 制 備 部 分
（8）沖 洗 溶 液
（9） 中 和 劑（ 經(jīng) 中 和 劑 鑒 定 試 驗(yàn) 合 格 ）
（10） 吐 溫80 ( 過(guò) 濾 除 菌 )
（11）去 離 子 水 或 蒸 餾 水滅 菌
(12)不銹鋼轉(zhuǎn)軸（由 一 條 直 徑0.16cm 不 銹 鋼 絲 制 成，如 圖2-2）
俯 視 圖 側(cè) 面 圖
圖2-2 纏 繞 測(cè) 試 布 條 的 不 銹 鋼 轉(zhuǎn) 軸
（13）有 金 屬 螺 蓋 的 玻 璃 罐（ 容 積 為470 ml ，可 高 壓 滅 菌 ， 并 可 放 入 轉(zhuǎn) 軸 的 廣 口罐），將 罐 口 覆 蓋 牛 皮 紙 ，加 蓋 ，于121*C滅 菌2 5 min 備 用。
（14）轉(zhuǎn) 動(dòng) 速 度 為45 r/ min～6 0 r/ min 的 滾 動(dòng) 搖 床
（15）可 調(diào) 恒 溫 水 浴 箱
（16）吸 管 ( 1ml， 5ml，和 10 ml)
（17）培 養(yǎng) 皿
（18）鋪 有 濾 紙 的 玻 璃 培 養(yǎng) 皿。
（29）菌 種 保 存 管
（20）細(xì) 菌 培 養(yǎng) 箱
（21）渦 流 振 蕩 器
（22）細(xì) 菌 比 濁 儀
（23）棉布（32支紗/cm×32支紗/cm平織棉布）
（24）別 針、鑷 子、無(wú) 菌 手 套 、3mm～5 mm玻 璃 珠 、秒 表、載 體 布片2.5cm×3.75cm ，見(jiàn) 測(cè) 試棉布 準(zhǔn) 備。
2.1.8.6.3實(shí) 驗(yàn) 準(zhǔn) 備
（1）測(cè) 試棉布的制備
①非 離 子 浸 潤(rùn) 劑 的 制 備：取5g烷 基 酚 聚 氧 乙 烯 醚 ，5 g 碳 酸 鈉 加 入 到1 L 去 離 子 水 中。
②洗 滌 液 的 制 備 ：1.5g 非 離 子 浸 潤(rùn) 劑 ，1.5g 碳 酸 鈉 ，加 入 到3 L 去 離 子 水 中。
將 大 約3 0 0 g 測(cè) 試 棉 布 加 入3 L 洗 滌 溶 液 。 加 熱 煮 沸 1h 。 取 出 棉 布 在 煮 沸 的去 離 子 水 中 清 洗 5 m i n 。 然 后 放 入 涼 去 離 子 水 中 5 min 。 以 去 除 殘 留 的 浸 潤(rùn)劑 。 然 后 將棉布 晾 干。
（2）測(cè) 試 棉 布 和 轉(zhuǎn) 動(dòng) 支 架 的 準(zhǔn) 備 ：取 處 理 過(guò) 的 棉 布，剪 成5 cm 寬 ，重 量 為15g *1 g的布 條，將 其 一 端 插 入 固 定 在 測(cè) 試 轉(zhuǎn) 動(dòng) 支 架 的 水 平 方 向 的 外 邊，然 后 在 3 條 水 平 支 架間 以 足 夠 的 張 力 纏 繞12個(gè) 整 圈 ，將 布 條 的 另 一 端 用 不 銹 鋼 別 針 固 定 在 前 一 圈 布 條上 。* 后 以
121℃ 壓 力 蒸 汽 滅 菌15 mi n ，備 用 。
（3） 細(xì) 菌 懸 液 的 制 備 ：取0. 5 ml營(yíng) 養(yǎng) 肉 湯 凍 干 的 菌 種 溶 解，接 種于含10 ml 的 營(yíng) 養(yǎng) 肉湯 的 試 管 ，于3 5 *C * 2 *C培 養(yǎng)2 4 h。 然 后， 振 蕩 混 合 均 勻 。用10μl 接 種 環(huán) 在 營(yíng)養(yǎng) 瓊 脂 平 板 上 劃 線 ，置 于35 *C * 2*C培 養(yǎng)2 4h。 然 后 ，從 平 板 上 挑 取 單 個(gè) 菌 落 種入 菌 種 保 藏 管 中 ，上 下 搖 動(dòng)10次 ，吸 棄 多 余 液 體 ， 置－8 0 *C冰 箱 保 存。 試 驗(yàn) 前 ，從菌 種 保 藏 管 中 取 出 1粒 帶 菌 小 顆 粒 放 入 營(yíng) 養(yǎng) 瓊 脂 斜 面 ，晃 動(dòng) 斜 面 。 將 斜 面 至3 5℃培 養(yǎng)2 4 h 。 每 天 轉(zhuǎn) 種1 次 ，連 續(xù) 傳 3 代 。
第四天，用5 m l P B S洗脫斜面上的菌苔，取0.5 ml加入到含9.5 ml PBS的試管中，混勻，取1 ml～2ml加入含有20 ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂B的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使菌液覆蓋整個(gè)瓊脂表面。吸棄多余菌液，然后將培養(yǎng)瓶倒置平放在35℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。
用5m l PBS和3g **玻璃珠洗脫細(xì)胞瓶中的菌體，用PBS調(diào)整濃度至1×108cf u/ml～5×108cfu/ml，然后加入3%的牛血清白蛋白。
（4）染菌載體的制備：每片載體接種20μl菌懸液，放回培養(yǎng)皿中，加蓋，于35℃*2℃在培養(yǎng)箱中干燥20min。
（5）測(cè)試樣品的制備：至少在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前20 m in，將盛有265ml硬水的玻璃罐在水浴箱中恒溫至測(cè)試溫度(25℃*1℃)。加入被測(cè)試樣品混合溶解。
2.1.8.6.4 試驗(yàn)步驟
（1）將兩片染菌載體放入轉(zhuǎn)動(dòng)支架的第6和7層布條之間，將第3片放入第7和8層布條之間。
（2）以 無(wú) 菌 操 作 方 式 將 轉(zhuǎn) 動(dòng) 單 元（ 支 架、 布 條 和 染 均 載 體）放 入 含 有 測(cè) 試 產(chǎn) 品 的 玻璃 罐 中 ，加 蓋 。
（3）玻璃 罐 固 定 在 搖 床 上 ，滾 動(dòng) 旋 轉(zhuǎn) 洗 滌20 m i n ，取 下 玻 璃 罐。
（4）以無(wú)菌操作方式，取出轉(zhuǎn)動(dòng)單元，取出3片染菌載體，放入到含有3 0ml中和劑（在測(cè)試**產(chǎn)品的**作用時(shí)，不加中和劑，只加入含0.5%吐溫80的PBS）的試管中，在振蕩器中混合10s。然后振打200次，用PBS做10倍系列稀釋?zhuān)⑦x擇適宜稀釋度樣液接種TSA平板。每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)平板。
（5）對(duì) 照 組 除 用 0.5 %（ V/V） 的 吐 溫8 0替 代 測(cè) 試 產(chǎn) 品 外 ，其 它 實(shí) 驗(yàn) 條 件 和 步 驟 均與 試 驗(yàn) 組 相 同 。
（6）菌 數(shù) 對(duì) 照: 將3片染 菌 載 體 加 入含 有3 0 ml 0.5 % 吐 溫8 0 的 PBS試 管 中 ，在 振 蕩器 振 蕩10s ，然 后 振 打2 0 0次 ，用PBS做10倍 系 列 稀 釋 ，并 取 適 宜 稀 釋 度 樣 液1.0ml，以 傾 注法 接 種TSA平 板，每 個(gè) 稀 釋 度 接 種 兩 個(gè) 平 板。
（7）將 試 驗(yàn) 組、對(duì)照 組 和 菌 數(shù) 對(duì) 照 組 平 板 倒 置 于3 5 ℃ ± 2℃ 培 養(yǎng) 箱 中 ，培 養(yǎng)4 8 h ±4 h，計(jì) 數(shù) 菌 落 數(shù) 。
（8）結(jié) 果計(jì) 算
試 驗(yàn) 重 復(fù)3次 。 記 錄 并 計(jì) 算 測(cè) 試 樣 品 的 細(xì) 菌 總 數(shù) 的 對(duì) 數(shù) 值 ， 求 其 平 均 值.。
2.1.8.6.5 評(píng) 價(jià) 規(guī) 定
按2.1.7.4.3（7）的 方 法 計(jì) 算 抑 菌 率 ，抑 菌 率 達(dá) 到5 0 % 可 判為 該 抗 菌 合 格 ；
按 2.1.1.7.4（6）方 法 計(jì) 算 殺 滅 對(duì) 數(shù) 值。殺 滅 對(duì) 數(shù) 值 ≥3.00，可 判 定 該 產(chǎn) 品為 消 毒 合格 。
2.1.8.6.6注意事項(xiàng)
（1）將旋轉(zhuǎn)單元放入玻璃罐后應(yīng)將蓋子蓋緊，以防轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)漏水。
（2）試驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，以防止雜菌污染。
2.1.8.7 振蕩燒瓶試驗(yàn)
2.1.8.7.1 原理
在液體中通過(guò)快速長(zhǎng)時(shí)間振蕩，增加微生物與抗（抑）菌產(chǎn)品內(nèi)抑菌劑的接觸以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)根據(jù)抑菌率大小判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于對(duì)非溶出性抗（抑）菌織物的鑒定。
2.1.8.7.2 試驗(yàn)器材
(1)金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大腸桿菌(8099)、白色*** (ATCC 10231)菌懸液的制備方法見(jiàn)2.1.1.2。根據(jù)抑菌劑特定用途也可用其他菌懸液。
(2)磷酸鹽緩沖液(PBS，0.03mol/L，pH值7.2～7.4)
(3)振蕩搖床 (300r/min)
(4)三角燒瓶
(5)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰 蛋 白 胨大 豆瓊 脂培 養(yǎng) 基（TSA）與沙堡瓊脂培養(yǎng)基
2.1.8.7.3 操作程序
（1）將**物品剪切成10mm×10mm樣片，稱(chēng)取0.75g分裝包好。
（2）將0.75g樣片放入250ml的三角燒瓶中，分別加入70ml PBS和5ml菌懸液，使菌懸液在PBS中的濃度為1×104cfu/ml～5×104 cfu/ml。
（3）將三角燒瓶固定于振蕩搖床上，在作用溫度為20℃～25℃的條件下，以300r/min振搖2min。吸取1.0ml用PBS作適當(dāng)稀釋只至10-2，作為試驗(yàn)組震蕩前樣液。
（4）將0.75g樣片放入上述含有70 mlPBS和5ml菌懸液的三角燒瓶中，然后將三角燒瓶固定于振蕩搖床上，在作用溫度為20℃～25℃的條件下，以300r/min振搖取0.5ml振搖1h。吸取1.0ml樣液，或用PBS作適當(dāng)稀釋后作為試驗(yàn)組振蕩后樣液。
（5）分別吸取振蕩前和振蕩后樣液各1.0ml，以瓊脂傾注法接種平皿，每個(gè)樣液接種兩個(gè)平皿，按照2.1.1.3規(guī)定的方法進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。
（6）試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照樣片和不加樣片組。對(duì)照樣片組以不含**劑的材質(zhì)、大小相同的樣片代替**樣片外，其它操作程序均與試驗(yàn)組相同。不加樣片組分別取5ml菌懸液和70mlPBS加入250ml三角燒瓶中，混勻，分別于振蕩前和振蕩后1h，各取1.0ml菌懸液與PBS的混合液做適當(dāng)稀釋。按2.1.1.2.3法進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。
（7）試驗(yàn)重復(fù)3次，按下列公式計(jì)算抑菌率
2.1.7.7.4 評(píng)價(jià)規(guī)定
(1)不加樣片組活菌計(jì)數(shù)在1×104cfu/ml～5×104cfu/ml，且樣本振蕩前后平均菌落數(shù)差值在 10%以?xún)?nèi)，試驗(yàn)有效。
(2)試驗(yàn)樣片抑菌率與對(duì)照樣片抑菌率的差值 > 26%，即可認(rèn)定該樣片具有**作用。
2.1.8.7.5 注意事項(xiàng)
(1) 振蕩前須將振蕩搖床上的三角燒瓶固定牢，以免碰破。
(2) 試驗(yàn)中，在實(shí)驗(yàn)誤差允許的范圍內(nèi)，如果試驗(yàn)組和對(duì)照組出現(xiàn)振蕩后菌落數(shù)高于振蕩前菌落數(shù)的情況，其抑菌率可按“0”計(jì)算。
2.1.8.8 浸漬試驗(yàn)
2.1.8.8.1原理
將試樣和對(duì)照織物分別放于三角瓶中，用含有肉湯培養(yǎng)基的試驗(yàn)菌懸液接種于試樣和對(duì)照織物上，經(jīng)培養(yǎng)后，分別將培養(yǎng)前后試樣上的**洗下，測(cè)定**的數(shù)量，可計(jì)算出試樣上**減少的百分率。該方法適用于溶出性**織物的檢測(cè)。
2.1.8.8.2試驗(yàn)器材
(1)試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌ATCC 6538
(2)試樣 將**織物剪成直徑為5cm的圓形樣片
(3)肉湯培養(yǎng)基
(4)胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基
(5)0.03mol/L磷酸鹽緩沖液 pH7.2
(6)恒溫水浴箱
(7)37℃培養(yǎng)箱
2.1.8.8.3試樣和菌懸液的制備
（1）試樣的制備：
距布邊10cm以上，離布端1m以上，剪直徑為5cm的圓形試樣若干，（需用試樣數(shù)量要根據(jù)纖維類(lèi)別及織物織法而定，以能吸收1ml菌液且三角瓶中不留殘液為度）。另剪取對(duì)照織物若干，取3份試樣和2份對(duì)照織物分別裝于三角瓶中，該好瓶口，121℃15min**備用。
(2) 菌懸液的制備
用接種環(huán)將保存的菌種以劃線法接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取平皿上典型的菌落移種到肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，在37℃條件下培養(yǎng)24h，用肉湯進(jìn)行系列稀釋?zhuān)咕鷳乙旱暮繛?×105cfu/ml～5×105cfu/ml。
2.1.8.8.4試驗(yàn)步驟
(1) 分別取1ml菌懸液加在三個(gè)準(zhǔn)備好的三角瓶?jī)?nèi)的織物上，確保其均勻分布，且三角瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸發(fā)。
(2)分別在一個(gè)盛有試樣和對(duì)照織物的三角瓶中加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min洗滌**，取1ml做10倍系列稀釋?zhuān)x適當(dāng)稀釋度以?xún)A注法接種平皿，作為“0”接觸時(shí)間樣品和對(duì)照織物上的**數(shù)。
(3)將另一個(gè)裝有接種試樣的三角瓶在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h±2h，然后加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min洗滌**，取1ml做10倍系列稀釋?zhuān)x適當(dāng)稀釋度以?xún)A注法接種平皿，作為試驗(yàn)組。
(4)陰性對(duì)照 試樣不接種菌懸液，在“0”接觸時(shí)間加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min取樣，接種平皿。
(5)陽(yáng)性對(duì)照另取1個(gè)裝有對(duì)照織物的三角燒瓶，接種1ml菌懸液后，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h±2h，然后加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min洗滌**，取1ml做10倍系列稀釋?zhuān)x適當(dāng)稀釋度以?xún)A注法接種平皿。
(6)將陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣本與試驗(yàn)組樣本一并放入37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。
(7)試驗(yàn)重復(fù)3次。
(8)結(jié)果計(jì)算
B或C或(B＋C)/2-A
抑菌率（%）= ×100
B或C或(B＋C)/2
A- 試驗(yàn)組試樣上的**數(shù)；
B- “0”接觸時(shí)間試樣上的**數(shù)；
C- “0”接觸時(shí)間對(duì)照織物上的**數(shù)；
如果“B”和“C”差別較大時(shí)，取較大值；如果“B”和“C”差別不大時(shí)，取平均值。
2.1.8.8.5評(píng)判規(guī)定
（1）“0”接觸時(shí)間對(duì)照織物的平均菌落數(shù)應(yīng)在1×103cfu/ml～5×103cfu/ml。
（2）陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照菌數(shù)比0接觸時(shí)間的菌數(shù)明顯增加。
（3）各次試驗(yàn)的抑菌率均≥50%，即可認(rèn)定該樣片具有**作用。
2.1.8.8.6 注意事項(xiàng)
（1）對(duì)織物進(jìn)行染菌操作時(shí)，應(yīng)確保其均勻分布，且三角瓶中不沾染或存留多余菌液。
（2）三角瓶?jī)?nèi)的織物染菌后，應(yīng)將瓶口封好，以防液體蒸發(fā)，造成**死亡。
2.1.8.9 奎因試驗(yàn)
2.1.8.9.1原理
將菌懸液直接滴于抗（抑）菌產(chǎn)品上，覆蓋以培養(yǎng)基，加強(qiáng)微生物和抑菌劑的接觸以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)根據(jù)抑菌率大小判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于對(duì)非溶出性硬質(zhì)表面抗（抑）菌產(chǎn)品的鑒定。
2.1.8.9.2 試驗(yàn)器材
（1）金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大腸桿菌(8099)、白色*** (ATCC 10231)菌懸液(見(jiàn)2.1.1.2)。根據(jù)抑菌劑特定用途所用的其他菌懸液。
（2）磷酸鹽緩沖液(PBS，0.03mol/L，pH為7.2～7.4)。
（3）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙堡瓊脂培養(yǎng)基和半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。
2.1.8.9.3 操作程序
（1）傾注瓊脂培養(yǎng)基平板。
（2）菌懸液的制備按2.1.1.2進(jìn)行。將菌懸液稀釋成105cfu/ml～106cfu/ml作為試驗(yàn)用菌懸液。
（3）將測(cè)試的抗（抑）菌產(chǎn)品剪切成50mm×50mm大小樣片，用75%乙醇**后，逐片平放于無(wú)菌平皿內(nèi)，取0.1ml試驗(yàn)用菌懸液滴染于樣片中央，涂勻，使菌液與樣片邊沿留有5mm的距離。置37℃溫箱內(nèi)干燥30min～60min，作為染菌的抗（抑）菌樣片備用。
（4）將染菌的抗（抑）菌樣片有菌面朝上平貼于無(wú)菌瓊脂平板表面。
（5）用半固體瓊脂3.0 ml～5.0ml，均勻覆蓋于染菌樣片表面，置37℃溫箱培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果。
（6）另將試驗(yàn)用菌懸液作適當(dāng)稀釋?zhuān)蛊錆舛葹?×103 cfu/ml～2×103cfu/ml，取其0.1ml滴染于不含抗（抑）菌劑的同質(zhì)樣片上，涂勻，與試驗(yàn)組樣片做同樣處理后，同放一平板內(nèi)，用半固體瓊脂覆蓋培養(yǎng)，作為陽(yáng)性對(duì)照。
（7）試驗(yàn)同時(shí)，試驗(yàn)菌懸液作活菌計(jì)數(shù)，并觀察不含抗（抑）菌劑的對(duì)照樣片受試菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)。
（8）試驗(yàn)重復(fù)3次。
（9）按下列公式計(jì)算抑菌率。
2.1.8.9.4 評(píng)價(jià)規(guī)定
陽(yáng)性對(duì)照生長(zhǎng)菌數(shù)≥100cfu/片，抑菌率≥99.00%，可判為有抑菌作用。
2.1.8.9.5 注意事項(xiàng)
（1）樣片滴染菌懸液時(shí)，勿溢出片外。
（2）覆蓋用瓊脂的溫度以在45℃～50℃間為宜，不可過(guò)熱。
2.1.8.1 目的
測(cè)定抗（抑）菌產(chǎn)品對(duì)**和**的抗（抑）菌作用。
常使用的方法有抑菌環(huán)試驗(yàn)、*小抑制濃度測(cè)定試驗(yàn)、滯 留 抑 菌 效 果 測(cè) 定 試 驗(yàn)、洗衣粉**效果測(cè)定試驗(yàn)、振蕩燒瓶試驗(yàn)、浸漬試驗(yàn)與奎因試驗(yàn)，可視情況選用。
2.1.8.2 抑菌環(huán)試驗(yàn)
2.1.8.2.1 原理
利用抑菌劑不斷溶解經(jīng)瓊脂擴(kuò)散形成不同濃度梯度，以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)通過(guò)抑菌環(huán)大小以判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于抑菌劑與溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的鑒定。
2.1.8.2.2 試驗(yàn)器材
(1)金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大腸桿菌(8099)、白色*** (ATCC 10231) 菌懸液(見(jiàn)2.1.1.2)及根據(jù)抑菌劑特定用途所用的其他菌懸液。
(2)抑菌劑載體 (5 mm 直徑園形新華一號(hào)定性濾紙片，經(jīng)壓力蒸汽**處理后，置 120℃ 烤干2h，保存?zhèn)溆?。
(3)活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所需器材(見(jiàn)2.1.1.3)。
(4)微量移液器(5μl～50μl，可調(diào)式)。
(5)游標(biāo)卡尺。
(6)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基與沙堡瓊脂培養(yǎng)基
2.1.8.2.3 操作程序
(1)抑菌片的制備:對(duì)液體抑菌劑，取無(wú)菌并干燥的濾紙片。每片滴加實(shí)際使用濃度抑菌劑溶液20μl，然后將濾紙片平放于清潔的無(wú)菌平皿內(nèi)，開(kāi)蓋置溫箱(37℃) 中烤干，或置室溫下自然干燥后備用。
溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品，可直接制成直徑為 5mm，厚不超過(guò) 4mm圓片(塊)，每 4 片(塊) 一組。
(2)陰性對(duì)照樣片的制備:取無(wú)菌干燥濾紙片，每片滴加無(wú)菌蒸餾水 20μl，干燥后備用。
溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的陰性對(duì)照樣本，應(yīng)取同種材質(zhì)不含抑菌成份的樣品，制成與試驗(yàn)組大小相同的樣片(塊)。
(3)試驗(yàn)菌的接種:用無(wú)菌棉拭子蘸取濃度為 5×105cfu/ml～5×106cfu/ml試驗(yàn)菌懸液，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面均勻涂抹3次。每涂抹1次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng) 60°，*后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿，置室溫干燥5min。
(4)抑菌劑樣片貼放:每次試驗(yàn)貼放1個(gè)染菌平板，每個(gè)平板貼放4片試驗(yàn)樣片，1 片陰性對(duì)照樣片，共 5片。用無(wú)菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各樣片中心之間相距 25mm以上，與平板的周緣相距 15mm以上。貼放好后，用無(wú)菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置37℃溫箱，培養(yǎng)16h～18h觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑 (包括貼片) 并記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。
測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)，應(yīng)選均勻而完全無(wú)菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)行。 測(cè)量其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界。
2.1.8.2.4 評(píng)價(jià)規(guī)定
(1)抑菌作用的判斷:
抑菌環(huán)直徑大于 7mm 者，判為有抑菌作用。
抑菌環(huán)直徑小于或等于 7mm 者，判為無(wú)抑菌作用。
(2) 3 次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格。
(3)陰性對(duì)照組應(yīng)無(wú)抑菌環(huán)產(chǎn)生。否則試驗(yàn)無(wú)效。
2.1.8.2.5 注意事項(xiàng)
(1)每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照，不可省略。在報(bào)告中亦必須將對(duì)照組的結(jié)果列出。
(2)接種用**懸液的濃度應(yīng)符合要求。濃度過(guò)低，接種菌量少，抑菌環(huán)常因之增大; 濃度過(guò)高，接種量過(guò)多，抑菌環(huán)則可減小。
(3)應(yīng)保持瓊脂濃度的準(zhǔn)確性，否則可影響抑菌環(huán)的大小。
(4)培養(yǎng)時(shí)間不得超過(guò) 18h。培養(yǎng)過(guò)久，部分**可恢復(fù)生長(zhǎng)，抑菌環(huán)變小。
(5)抑菌環(huán)直徑可受抑菌劑的量、抑菌性能和干濕度影響。故抑菌劑濾紙片應(yīng)在試驗(yàn)當(dāng)天制備。
2.1.8.3 *小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)（瓊脂稀釋法）
2.1.8.3.1原理
本試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法將不同濃度的抑菌劑混合溶解在瓊脂培養(yǎng)基中，然后點(diǎn)種**，通過(guò)**的生長(zhǎng)與否，確定抗（抑）菌物質(zhì)抑制受試菌生長(zhǎng)的*低濃度，即*小抑菌濃度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)。本方法適用于不溶性抗（抑）菌產(chǎn)品。
2.1.8.3.2 試驗(yàn)器材
（1）菌株
金黃色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大腸桿菌 8099或ATCC 11229。
可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株。
（2）水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MH），稱(chēng)取38gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中，加熱至沸騰溶解，然后121℃高壓**15min，置45℃～50℃水浴備用，此培養(yǎng)基將用于對(duì)照試驗(yàn)。
（3）0.03mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.2。
（4）加樣器（1μl～10μl）。
（5）45℃～50℃水浴恒溫箱。
（6）吸管、試管、平皿。
（7）37℃培養(yǎng)箱。
2.1.8.3.3 操作步驟
（1）抗（抑）菌溶液的配制：以無(wú)菌操作取5ml或5g（固體研磨后）樣品，放入45ml**磷酸緩沖液中，充分震蕩溶解，配成10%的均勻分散的溶液或懸液。
（2）含**劑培養(yǎng)基配制：將已配成10%的抗（抑）菌溶液或懸液用PBS做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，置45℃～50℃水浴恒溫備用。
（3）雙倍濃度培養(yǎng)基配制：稱(chēng)取76gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中。加熱至沸騰溶解。然后121℃壓力蒸汽**15min，置45℃～50℃水浴備用。此培養(yǎng)基將用于稀釋抗（抑）菌溶液或懸液。
（4）含抗（抑）菌液培養(yǎng)基的配制：分別取10ml系列稀釋的**液加入平皿內(nèi)。將在45℃～50℃水浴中的雙倍MH瓊脂培養(yǎng)基10ml，加入平皿內(nèi)，邊加邊搖晃平板，使抗（抑）菌液和培養(yǎng)基充分混勻，待凝固后備用。
（5）用加樣器取1μl～2μl（含菌量約為107cfu/ml）菌懸液點(diǎn)種于含抗（抑）菌液培養(yǎng)基的平皿，接種后所形成的菌液圈直徑約5mm～8mm（每個(gè)點(diǎn)菌量約為104cfu）。
（6）以同樣方法接種不含抗（抑）菌成分的MH瓊脂平板，作為陽(yáng)性對(duì)照。
（7）將接種后的平板放置35℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果。
2.1.8.3.4 評(píng)判規(guī)定
菌落生長(zhǎng)被完全抑制的*低抗（抑）菌液濃度為該樣品對(duì)受試菌的MIC。單一菌落生長(zhǎng)可忽略不計(jì)。
2.1.8.3.5 注意事項(xiàng)
（1）接種時(shí)，應(yīng)由低抗（抑）菌劑濃度向高濃度平板依次接種，*后接種對(duì)照平板。
（2）為了保證平板受熱均勻，培養(yǎng)時(shí)平板堆放不得超過(guò)4個(gè)。
2.1.8.4 *小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)（營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋法）
2.1.8.4.1原理
本試驗(yàn)將不同濃度的抑菌劑混合溶解于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，然后接種**，通過(guò)**的生長(zhǎng)與否，確定抗（抑）菌劑抑制受試菌生長(zhǎng)的*低濃度，即*小抑菌濃度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)。本方法式用于可溶性抑菌產(chǎn)品。
2.1.8.4.2 試驗(yàn)器材
（1）試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大腸桿菌 8099或ATCC 11229。
可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株。
（2）營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，見(jiàn)附錄A。
（3）稀釋液，見(jiàn)附錄A。
（4）吸管、試管
（5）37℃培養(yǎng)箱。
2.1.8.4.3 操作步驟
（1）按 2.1.1.2 所示方法制備的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌懸液
（2）含**劑培養(yǎng)基配制：將抗（抑）菌溶液用蒸餾水做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，取各稀釋度受試液2.5ml加入到含2.5ml雙倍濃度營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中。
（3）取0.1ml含菌量約為108cfu/ml菌懸液接種于含抗（抑）菌劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為試驗(yàn)組樣本。
（4）以同樣方法接種不含抗（抑）菌劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為陽(yáng)性對(duì)照組樣本。
（5）取2支含營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為陰性對(duì)照組樣本。
（6）將試驗(yàn)組樣本、陽(yáng)性對(duì)照組樣本及陰性對(duì)照組樣本放置37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。
（7）試驗(yàn)中應(yīng)將試驗(yàn)用菌懸液進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，其作用濃度應(yīng)為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。
2.1.8.4.4 評(píng)判規(guī)定
當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照管有**生長(zhǎng)(混濁)，陰性對(duì)照管無(wú)菌生長(zhǎng)(透明)，試驗(yàn)用菌懸液的作用濃度為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml時(shí)，試驗(yàn)組無(wú)菌生長(zhǎng)的*高稀釋度所對(duì)應(yīng)的抗（抑）菌劑濃度，為該樣品對(duì)受試菌的MIC。
2.1.8.4.5 注意事項(xiàng)
接種時(shí)，應(yīng)由低抗（抑）菌劑濃度向高濃度依次接種，
2.1.8.5 滯 留 抑 菌 效果 試 驗(yàn)
2.1.8.5.1 原 理
本試驗(yàn)通過(guò)模擬適合**生長(zhǎng)、繁殖和可能產(chǎn)生感染的皮膚條件下，使用隨機(jī)性、雙盲的、配對(duì)比較的方法檢測(cè)抗（抑）菌香皂和**沐浴露12h或24h的滯留抑菌效果。
2.1.8.5.2試驗(yàn)器材
(1) 試驗(yàn)產(chǎn)品: 試驗(yàn)品為25套按順序編號(hào)的香皂樣品。每套2塊，一塊為測(cè)試樣品皂，另一塊為不含抑菌劑的對(duì)照皂。
(2) 不含抑菌劑的洗發(fā)水 25瓶（200ml/瓶）
(3) 不含抑菌劑的香皂 25塊
(4) 胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)
(5) 胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）
(6) 0.075mol/L的磷酸鹽緩沖液
(7) 70%酒精
(8) 恒溫箱
(9) 金屬筒 （直徑2.2cm、高度3cm）
(10) 一次性接種環(huán)（直徑4mm）
(11) 小塑料碗（直徑2.2cm，高2.5mm，）
(12) 膠帶（Darapore，3M公司生產(chǎn)）
(13) 尼龍刮菌棒
(14) Triton-X 100 500ml
(15) 外用***軟膏(例如:百多邦莫匹羅星軟膏)
(16) 玻璃彎棒
(17) 羊血
(18) 金黃色葡萄球菌ATCC27217（此株金黃色葡萄球菌是一種低毒性、對(duì)青霉素敏感、對(duì)四環(huán)素有抗藥性的色素株，曾用于許多試驗(yàn)研究，沒(méi)有任何嚴(yán)重副作用）。
(19) 皮膚**劑
2.1.8.5.3 試驗(yàn)步驟
(1)調(diào)整階段
試驗(yàn)開(kāi)始前7d至14d，受試者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗發(fā)水和沐浴液進(jìn)行日常的洗手、洗澡。此階段持續(xù)至少7d，但不超過(guò)14d。
(2)清洗階段
清洗階段共3d，受試者每天用抑菌皂清洗一側(cè)前臂，用對(duì)照皂清洗另一側(cè)前臂，清洗過(guò)程如下:
1）先清洗左臂，用流動(dòng)水（水溫應(yīng)保持在35℃～37℃）打濕前臂內(nèi)側(cè)；
2）用香皂從手腕至臂肘上下摩擦15s；
3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫45s；
4）用流動(dòng)的清水沖洗前臂15s，不要搓擦；
5）用紙巾沾干前臂. 不要搓擦；
6）重復(fù)以上步驟清洗右臂；
7）按上面所描述的試驗(yàn)步驟每日清洗前臂3次，每次間隔至少一個(gè)小時(shí)，在*后一次清洗之后，需記錄好時(shí)間，在12h之后，進(jìn)行滯留效果檢測(cè)。在第9次清洗前臂以后，受試者不能洗澡、淋浴或洗凈前臂，直到試驗(yàn)結(jié)束。用品包的標(biāo)簽上注明洗哪只手臂。清洗前后的兩塊香皂的重量及受試者完成清洗的情況，須記錄下來(lái)。
（3）試驗(yàn)階段
清洗階段的第四天(*后一次清洗后12h或24h)，將在受試者每只前臂上劃出一個(gè)試驗(yàn)區(qū)，對(duì)試驗(yàn)區(qū)進(jìn)行接種、封包和回收存活**，具體步驟如下:
1）將金黃色葡萄球菌（ATCC27217）連續(xù)轉(zhuǎn)種3代，取第3代培養(yǎng)物接種于胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）中，在35℃±2℃的條件下培養(yǎng)20h±2h。然后用胰蛋白酶大豆肉湯適當(dāng)稀釋菌懸液，使菌懸液濃度約為108cfu/ml～109cfu/ml。
2）**接種:在受試者的每只前臂中間部位（不要在手腕和肘皺褶處），用帶有印墨直徑為3.0cm的玻璃量筒扣在皮膚上，劃分出一個(gè)試驗(yàn)區(qū)。使用加樣器取10μl上述菌懸液，接種于前臂試驗(yàn)區(qū)（菌落數(shù)為106cfu/試驗(yàn)區(qū)～107cfu/試驗(yàn)區(qū)），用一次性接種環(huán)，把接種物涂成一圓形，使其與試驗(yàn)區(qū)邊緣應(yīng)有4mm～5mm的距離。
3）封包:**接種后立即用小塑料碗扣于染菌區(qū)上面 ，再用膠帶將小塑料碗固定在皮膚上，記錄封包的時(shí)間。
4）回收存活**：接種后2h±5min對(duì)前臂上接種的區(qū)域進(jìn)行取樣。將金屬筒放置于試驗(yàn)區(qū)中間部位，不要接觸到蓋有印墨的邊緣。將1ml含0.1%triton-X100的0.075mol/L磷酸鹽緩沖液吸移至金屬筒內(nèi)，用尼龍刮菌棒刮洗金屬筒罩住區(qū)域內(nèi)的皮膚60s，將筒內(nèi)液體吸移至試管內(nèi)，再加1ml含0.1%tritonX-100的0.075mol/L磷酸鹽緩沖液，對(duì)該區(qū)域內(nèi)的皮膚進(jìn)行第2次刮洗30s，將第2次擦洗的液體，注入含第1次刮洗液體的試管中。
5）實(shí)驗(yàn)區(qū)試驗(yàn)后的**處理:一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)采樣之后，需用70%的酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行**。然后對(duì)另一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)以同樣方法進(jìn)行采樣，采樣結(jié)束后，先用70%的酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行**，然后用皮膚**劑對(duì)兩只前臂進(jìn)行**處理，處理后清水沖洗，擦干，再涂少量的***軟膏。
6）平皿接種與培養(yǎng):對(duì)每一個(gè)取樣進(jìn)行平皿接種，以0.0375mol/L磷酸鹽緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)x適當(dāng)稀釋度取0.1ml接種于2個(gè)含5%羊血的TSA平板表面，用玻璃彎棒涂勻，在35℃±2℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±4h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。
7）抑菌率的計(jì)算
抑菌率=[ （對(duì)照平均菌落數(shù)－試驗(yàn)平均菌落數(shù)）/ 對(duì)照平均菌落數(shù)] ×100%
2.1.8.5.4 判定標(biāo)準(zhǔn)
試驗(yàn)不得少于16人次，抑菌率≥50%，可判定該產(chǎn)品在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)有滯留抑菌作用。
2.1.8.5.5注意事項(xiàng)
（1）受試者錄用標(biāo)準(zhǔn)
①年齡介于18歲至65歲的男性或女性；
②受試者應(yīng)身體健康；
③前臂應(yīng)完好無(wú)損且沒(méi)有皮膚病及其它皮膚問(wèn)題；
④同意在整個(gè)試驗(yàn)期間，避免使用抗（抑）菌洗液和乳膏、局部類(lèi)固醇類(lèi)藥和全身或局部使用***，除非因?yàn)椴l(fā)病癥醫(yī)生要求使用；
⑤同意在清洗階段使用非**香皂或洗液洗澡和淋浴，但受試者不能清洗前臂。在第9次洗完前臂以后，不洗澡，淋浴或洗凈前臂，直到試驗(yàn)結(jié)束。
（2）排除受試者的標(biāo)準(zhǔn) 如果受試者有下列情況之一，不能被錄用參加試驗(yàn)
① 同時(shí)參加另外一個(gè)臨床試驗(yàn)
② 在過(guò)去的14d中，參加過(guò)任何一種形式的關(guān)于清潔手或手臂的試驗(yàn)
③ 對(duì)香皂、去污劑、香水或青霉素過(guò)敏
④ 懷孕婦女
⑤ 診斷患有糖尿病、肝炎、艾滋?。℉IV陽(yáng)性）、器官移植者，
（3）其它試驗(yàn)限制
① 受試者不得使用其它清潔用品；
② 受試者應(yīng)避免洗熱水盆浴和游泳；
③ 受試者應(yīng)避免接觸未干的油漆、涂料或者其它溶劑；
④ 受試者應(yīng)避免在手腕處和前臂上噴灑香水。
（4）在試驗(yàn)完成后的48h～72h內(nèi)，需檢查前臂上有無(wú)小**、水皰，隆起的紅色癢皰。出現(xiàn)這些情況的受試者應(yīng)盡快通知檢驗(yàn)單位。
2.1.8.6洗衣粉抗（抑）菌效果鑒定方法8
2.1.8.6.1 原 理
本 方 法 通過(guò) 模 擬 洗 衣 機(jī) 的 洗 衣 過(guò) 程 ，檢 測(cè) 抗 （抑）菌 洗 衣 粉（劑）的 抗 菌 作 用 。
2.1.8.6.2 試 驗(yàn) 器 材
（1） 試 驗(yàn) 菌 株
大 腸 桿 菌 A T C C 1 1 2 2 9，金 黃 色 葡 萄 球 菌 A T C C 6 5 3 8。
（2）培 養(yǎng) 基
營(yíng) 養(yǎng) 瓊 脂（ 瓊 脂 含 量 為1.5%）
營(yíng)養(yǎng)瓊脂A：在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中另加入1.5 %的瓊脂。
TSA營(yíng)養(yǎng)肉湯。
（3）牛 血 清 白 蛋 白（ 過(guò) 濾 除 菌）
（4）烷 基 酚 聚 氧 乙 烯 醚 （Tergitol ）
（5）碳 酸 鈉
（6）標(biāo)準(zhǔn) 硬 水
（7）非 離 子 浸 濕 劑 ： 見(jiàn) 測(cè) 試 棉布 制 備 部 分
（8）沖 洗 溶 液
（9） 中 和 劑（ 經(jīng) 中 和 劑 鑒 定 試 驗(yàn) 合 格 ）
（10） 吐 溫80 ( 過(guò) 濾 除 菌 )
（11）去 離 子 水 或 蒸 餾 水滅 菌
(12)不銹鋼轉(zhuǎn)軸（由 一 條 直 徑0.16cm 不 銹 鋼 絲 制 成，如 圖2-2）
俯 視 圖 側(cè) 面 圖
圖2-2 纏 繞 測(cè) 試 布 條 的 不 銹 鋼 轉(zhuǎn) 軸
（13）有 金 屬 螺 蓋 的 玻 璃 罐（ 容 積 為470 ml ，可 高 壓 滅 菌 ， 并 可 放 入 轉(zhuǎn) 軸 的 廣 口罐），將 罐 口 覆 蓋 牛 皮 紙 ，加 蓋 ，于121*C滅 菌2 5 min 備 用。
（14）轉(zhuǎn) 動(dòng) 速 度 為45 r/ min～6 0 r/ min 的 滾 動(dòng) 搖 床
（15）可 調(diào) 恒 溫 水 浴 箱
（16）吸 管 ( 1ml， 5ml，和 10 ml)
（17）培 養(yǎng) 皿
（18）鋪 有 濾 紙 的 玻 璃 培 養(yǎng) 皿。
（29）菌 種 保 存 管
（20）細(xì) 菌 培 養(yǎng) 箱
（21）渦 流 振 蕩 器
（22）細(xì) 菌 比 濁 儀
（23）棉布（32支紗/cm×32支紗/cm平織棉布）
（24）別 針、鑷 子、無(wú) 菌 手 套 、3mm～5 mm玻 璃 珠 、秒 表、載 體 布片2.5cm×3.75cm ，見(jiàn) 測(cè) 試棉布 準(zhǔn) 備。
2.1.8.6.3實(shí) 驗(yàn) 準(zhǔn) 備
（1）測(cè) 試棉布的制備
①非 離 子 浸 潤(rùn) 劑 的 制 備：取5g烷 基 酚 聚 氧 乙 烯 醚 ，5 g 碳 酸 鈉 加 入 到1 L 去 離 子 水 中。
②洗 滌 液 的 制 備 ：1.5g 非 離 子 浸 潤(rùn) 劑 ，1.5g 碳 酸 鈉 ，加 入 到3 L 去 離 子 水 中。
將 大 約3 0 0 g 測(cè) 試 棉 布 加 入3 L 洗 滌 溶 液 。 加 熱 煮 沸 1h 。 取 出 棉 布 在 煮 沸 的去 離 子 水 中 清 洗 5 m i n 。 然 后 放 入 涼 去 離 子 水 中 5 min 。 以 去 除 殘 留 的 浸 潤(rùn)劑 。 然 后 將棉布 晾 干。
（2）測(cè) 試 棉 布 和 轉(zhuǎn) 動(dòng) 支 架 的 準(zhǔn) 備 ：取 處 理 過(guò) 的 棉 布，剪 成5 cm 寬 ，重 量 為15g *1 g的布 條，將 其 一 端 插 入 固 定 在 測(cè) 試 轉(zhuǎn) 動(dòng) 支 架 的 水 平 方 向 的 外 邊，然 后 在 3 條 水 平 支 架間 以 足 夠 的 張 力 纏 繞12個(gè) 整 圈 ，將 布 條 的 另 一 端 用 不 銹 鋼 別 針 固 定 在 前 一 圈 布 條上 。* 后 以
121℃ 壓 力 蒸 汽 滅 菌15 mi n ，備 用 。
（3） 細(xì) 菌 懸 液 的 制 備 ：取0. 5 ml營(yíng) 養(yǎng) 肉 湯 凍 干 的 菌 種 溶 解，接 種于含10 ml 的 營(yíng) 養(yǎng) 肉湯 的 試 管 ，于3 5 *C * 2 *C培 養(yǎng)2 4 h。 然 后， 振 蕩 混 合 均 勻 。用10μl 接 種 環(huán) 在 營(yíng)養(yǎng) 瓊 脂 平 板 上 劃 線 ，置 于35 *C * 2*C培 養(yǎng)2 4h。 然 后 ，從 平 板 上 挑 取 單 個(gè) 菌 落 種入 菌 種 保 藏 管 中 ，上 下 搖 動(dòng)10次 ，吸 棄 多 余 液 體 ， 置－8 0 *C冰 箱 保 存。 試 驗(yàn) 前 ，從菌 種 保 藏 管 中 取 出 1粒 帶 菌 小 顆 粒 放 入 營(yíng) 養(yǎng) 瓊 脂 斜 面 ，晃 動(dòng) 斜 面 。 將 斜 面 至3 5℃培 養(yǎng)2 4 h 。 每 天 轉(zhuǎn) 種1 次 ，連 續(xù) 傳 3 代 。
第四天，用5 m l P B S洗脫斜面上的菌苔，取0.5 ml加入到含9.5 ml PBS的試管中，混勻，取1 ml～2ml加入含有20 ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂B的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使菌液覆蓋整個(gè)瓊脂表面。吸棄多余菌液，然后將培養(yǎng)瓶倒置平放在35℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。
用5m l PBS和3g **玻璃珠洗脫細(xì)胞瓶中的菌體，用PBS調(diào)整濃度至1×108cf u/ml～5×108cfu/ml，然后加入3%的牛血清白蛋白。
（4）染菌載體的制備：每片載體接種20μl菌懸液，放回培養(yǎng)皿中，加蓋，于35℃*2℃在培養(yǎng)箱中干燥20min。
（5）測(cè)試樣品的制備：至少在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前20 m in，將盛有265ml硬水的玻璃罐在水浴箱中恒溫至測(cè)試溫度(25℃*1℃)。加入被測(cè)試樣品混合溶解。
2.1.8.6.4 試驗(yàn)步驟
（1）將兩片染菌載體放入轉(zhuǎn)動(dòng)支架的第6和7層布條之間，將第3片放入第7和8層布條之間。
（2）以 無(wú) 菌 操 作 方 式 將 轉(zhuǎn) 動(dòng) 單 元（ 支 架、 布 條 和 染 均 載 體）放 入 含 有 測(cè) 試 產(chǎn) 品 的 玻璃 罐 中 ，加 蓋 。
（3）玻璃 罐 固 定 在 搖 床 上 ，滾 動(dòng) 旋 轉(zhuǎn) 洗 滌20 m i n ，取 下 玻 璃 罐。
（4）以無(wú)菌操作方式，取出轉(zhuǎn)動(dòng)單元，取出3片染菌載體，放入到含有3 0ml中和劑（在測(cè)試**產(chǎn)品的**作用時(shí)，不加中和劑，只加入含0.5%吐溫80的PBS）的試管中，在振蕩器中混合10s。然后振打200次，用PBS做10倍系列稀釋?zhuān)⑦x擇適宜稀釋度樣液接種TSA平板。每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)平板。
（5）對(duì) 照 組 除 用 0.5 %（ V/V） 的 吐 溫8 0替 代 測(cè) 試 產(chǎn) 品 外 ，其 它 實(shí) 驗(yàn) 條 件 和 步 驟 均與 試 驗(yàn) 組 相 同 。
（6）菌 數(shù) 對(duì) 照: 將3片染 菌 載 體 加 入含 有3 0 ml 0.5 % 吐 溫8 0 的 PBS試 管 中 ，在 振 蕩器 振 蕩10s ，然 后 振 打2 0 0次 ，用PBS做10倍 系 列 稀 釋 ，并 取 適 宜 稀 釋 度 樣 液1.0ml，以 傾 注法 接 種TSA平 板，每 個(gè) 稀 釋 度 接 種 兩 個(gè) 平 板。
（7）將 試 驗(yàn) 組、對(duì)照 組 和 菌 數(shù) 對(duì) 照 組 平 板 倒 置 于3 5 ℃ ± 2℃ 培 養(yǎng) 箱 中 ，培 養(yǎng)4 8 h ±4 h，計(jì) 數(shù) 菌 落 數(shù) 。
（8）結(jié) 果計(jì) 算
試 驗(yàn) 重 復(fù)3次 。 記 錄 并 計(jì) 算 測(cè) 試 樣 品 的 細(xì) 菌 總 數(shù) 的 對(duì) 數(shù) 值 ， 求 其 平 均 值.。
2.1.8.6.5 評(píng) 價(jià) 規(guī) 定
按2.1.7.4.3（7）的 方 法 計(jì) 算 抑 菌 率 ，抑 菌 率 達(dá) 到5 0 % 可 判為 該 抗 菌 合 格 ；
按 2.1.1.7.4（6）方 法 計(jì) 算 殺 滅 對(duì) 數(shù) 值。殺 滅 對(duì) 數(shù) 值 ≥3.00，可 判 定 該 產(chǎn) 品為 消 毒 合格 。
2.1.8.6.6注意事項(xiàng)
（1）將旋轉(zhuǎn)單元放入玻璃罐后應(yīng)將蓋子蓋緊，以防轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)漏水。
（2）試驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，以防止雜菌污染。
2.1.8.7 振蕩燒瓶試驗(yàn)
2.1.8.7.1 原理
在液體中通過(guò)快速長(zhǎng)時(shí)間振蕩，增加微生物與抗（抑）菌產(chǎn)品內(nèi)抑菌劑的接觸以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)根據(jù)抑菌率大小判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于對(duì)非溶出性抗（抑）菌織物的鑒定。
2.1.8.7.2 試驗(yàn)器材
(1)金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大腸桿菌(8099)、白色*** (ATCC 10231)菌懸液的制備方法見(jiàn)2.1.1.2。根據(jù)抑菌劑特定用途也可用其他菌懸液。
(2)磷酸鹽緩沖液(PBS，0.03mol/L，pH值7.2～7.4)
(3)振蕩搖床 (300r/min)
(4)三角燒瓶
(5)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰 蛋 白 胨大 豆瓊 脂培 養(yǎng) 基（TSA）與沙堡瓊脂培養(yǎng)基
2.1.8.7.3 操作程序
（1）將**物品剪切成10mm×10mm樣片，稱(chēng)取0.75g分裝包好。
（2）將0.75g樣片放入250ml的三角燒瓶中，分別加入70ml PBS和5ml菌懸液，使菌懸液在PBS中的濃度為1×104cfu/ml～5×104 cfu/ml。
（3）將三角燒瓶固定于振蕩搖床上，在作用溫度為20℃～25℃的條件下，以300r/min振搖2min。吸取1.0ml用PBS作適當(dāng)稀釋只至10-2，作為試驗(yàn)組震蕩前樣液。
（4）將0.75g樣片放入上述含有70 mlPBS和5ml菌懸液的三角燒瓶中，然后將三角燒瓶固定于振蕩搖床上，在作用溫度為20℃～25℃的條件下，以300r/min振搖取0.5ml振搖1h。吸取1.0ml樣液，或用PBS作適當(dāng)稀釋后作為試驗(yàn)組振蕩后樣液。
（5）分別吸取振蕩前和振蕩后樣液各1.0ml，以瓊脂傾注法接種平皿，每個(gè)樣液接種兩個(gè)平皿，按照2.1.1.3規(guī)定的方法進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。
（6）試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照樣片和不加樣片組。對(duì)照樣片組以不含**劑的材質(zhì)、大小相同的樣片代替**樣片外，其它操作程序均與試驗(yàn)組相同。不加樣片組分別取5ml菌懸液和70mlPBS加入250ml三角燒瓶中，混勻，分別于振蕩前和振蕩后1h，各取1.0ml菌懸液與PBS的混合液做適當(dāng)稀釋。按2.1.1.2.3法進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。
（7）試驗(yàn)重復(fù)3次，按下列公式計(jì)算抑菌率
2.1.7.7.4 評(píng)價(jià)規(guī)定
(1)不加樣片組活菌計(jì)數(shù)在1×104cfu/ml～5×104cfu/ml，且樣本振蕩前后平均菌落數(shù)差值在 10%以?xún)?nèi)，試驗(yàn)有效。
(2)試驗(yàn)樣片抑菌率與對(duì)照樣片抑菌率的差值 > 26%，即可認(rèn)定該樣片具有**作用。
2.1.8.7.5 注意事項(xiàng)
(1) 振蕩前須將振蕩搖床上的三角燒瓶固定牢，以免碰破。
(2) 試驗(yàn)中，在實(shí)驗(yàn)誤差允許的范圍內(nèi)，如果試驗(yàn)組和對(duì)照組出現(xiàn)振蕩后菌落數(shù)高于振蕩前菌落數(shù)的情況，其抑菌率可按“0”計(jì)算。
2.1.8.8 浸漬試驗(yàn)
2.1.8.8.1原理
將試樣和對(duì)照織物分別放于三角瓶中，用含有肉湯培養(yǎng)基的試驗(yàn)菌懸液接種于試樣和對(duì)照織物上，經(jīng)培養(yǎng)后，分別將培養(yǎng)前后試樣上的**洗下，測(cè)定**的數(shù)量，可計(jì)算出試樣上**減少的百分率。該方法適用于溶出性**織物的檢測(cè)。
2.1.8.8.2試驗(yàn)器材
(1)試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌ATCC 6538
(2)試樣 將**織物剪成直徑為5cm的圓形樣片
(3)肉湯培養(yǎng)基
(4)胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基
(5)0.03mol/L磷酸鹽緩沖液 pH7.2
(6)恒溫水浴箱
(7)37℃培養(yǎng)箱
2.1.8.8.3試樣和菌懸液的制備
（1）試樣的制備：
距布邊10cm以上，離布端1m以上，剪直徑為5cm的圓形試樣若干，（需用試樣數(shù)量要根據(jù)纖維類(lèi)別及織物織法而定，以能吸收1ml菌液且三角瓶中不留殘液為度）。另剪取對(duì)照織物若干，取3份試樣和2份對(duì)照織物分別裝于三角瓶中，該好瓶口，121℃15min**備用。
(2) 菌懸液的制備
用接種環(huán)將保存的菌種以劃線法接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取平皿上典型的菌落移種到肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，在37℃條件下培養(yǎng)24h，用肉湯進(jìn)行系列稀釋?zhuān)咕鷳乙旱暮繛?×105cfu/ml～5×105cfu/ml。
2.1.8.8.4試驗(yàn)步驟
(1) 分別取1ml菌懸液加在三個(gè)準(zhǔn)備好的三角瓶?jī)?nèi)的織物上，確保其均勻分布，且三角瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸發(fā)。
(2)分別在一個(gè)盛有試樣和對(duì)照織物的三角瓶中加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min洗滌**，取1ml做10倍系列稀釋?zhuān)x適當(dāng)稀釋度以?xún)A注法接種平皿，作為“0”接觸時(shí)間樣品和對(duì)照織物上的**數(shù)。
(3)將另一個(gè)裝有接種試樣的三角瓶在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h±2h，然后加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min洗滌**，取1ml做10倍系列稀釋?zhuān)x適當(dāng)稀釋度以?xún)A注法接種平皿，作為試驗(yàn)組。
(4)陰性對(duì)照 試樣不接種菌懸液，在“0”接觸時(shí)間加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min取樣，接種平皿。
(5)陽(yáng)性對(duì)照另取1個(gè)裝有對(duì)照織物的三角燒瓶，接種1ml菌懸液后，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h±2h，然后加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min洗滌**，取1ml做10倍系列稀釋?zhuān)x適當(dāng)稀釋度以?xún)A注法接種平皿。
(6)將陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣本與試驗(yàn)組樣本一并放入37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。
(7)試驗(yàn)重復(fù)3次。
(8)結(jié)果計(jì)算
B或C或(B＋C)/2-A
抑菌率（%）= ×100
B或C或(B＋C)/2
A- 試驗(yàn)組試樣上的**數(shù)；
B- “0”接觸時(shí)間試樣上的**數(shù)；
C- “0”接觸時(shí)間對(duì)照織物上的**數(shù)；
如果“B”和“C”差別較大時(shí)，取較大值；如果“B”和“C”差別不大時(shí)，取平均值。
2.1.8.8.5評(píng)判規(guī)定
（1）“0”接觸時(shí)間對(duì)照織物的平均菌落數(shù)應(yīng)在1×103cfu/ml～5×103cfu/ml。
（2）陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照菌數(shù)比0接觸時(shí)間的菌數(shù)明顯增加。
（3）各次試驗(yàn)的抑菌率均≥50%，即可認(rèn)定該樣片具有**作用。
2.1.8.8.6 注意事項(xiàng)
（1）對(duì)織物進(jìn)行染菌操作時(shí)，應(yīng)確保其均勻分布，且三角瓶中不沾染或存留多余菌液。
（2）三角瓶?jī)?nèi)的織物染菌后，應(yīng)將瓶口封好，以防液體蒸發(fā)，造成**死亡。
2.1.8.9 奎因試驗(yàn)
2.1.8.9.1原理
將菌懸液直接滴于抗（抑）菌產(chǎn)品上，覆蓋以培養(yǎng)基，加強(qiáng)微生物和抑菌劑的接觸以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)根據(jù)抑菌率大小判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于對(duì)非溶出性硬質(zhì)表面抗（抑）菌產(chǎn)品的鑒定。
2.1.8.9.2 試驗(yàn)器材
（1）金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大腸桿菌(8099)、白色*** (ATCC 10231)菌懸液(見(jiàn)2.1.1.2)。根據(jù)抑菌劑特定用途所用的其他菌懸液。
（2）磷酸鹽緩沖液(PBS，0.03mol/L，pH為7.2～7.4)。
（3）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙堡瓊脂培養(yǎng)基和半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。
2.1.8.9.3 操作程序
（1）傾注瓊脂培養(yǎng)基平板。
（2）菌懸液的制備按2.1.1.2進(jìn)行。將菌懸液稀釋成105cfu/ml～106cfu/ml作為試驗(yàn)用菌懸液。
（3）將測(cè)試的抗（抑）菌產(chǎn)品剪切成50mm×50mm大小樣片，用75%乙醇**后，逐片平放于無(wú)菌平皿內(nèi)，取0.1ml試驗(yàn)用菌懸液滴染于樣片中央，涂勻，使菌液與樣片邊沿留有5mm的距離。置37℃溫箱內(nèi)干燥30min～60min，作為染菌的抗（抑）菌樣片備用。
（4）將染菌的抗（抑）菌樣片有菌面朝上平貼于無(wú)菌瓊脂平板表面。
（5）用半固體瓊脂3.0 ml～5.0ml，均勻覆蓋于染菌樣片表面，置37℃溫箱培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果。
（6）另將試驗(yàn)用菌懸液作適當(dāng)稀釋?zhuān)蛊錆舛葹?×103 cfu/ml～2×103cfu/ml，取其0.1ml滴染于不含抗（抑）菌劑的同質(zhì)樣片上，涂勻，與試驗(yàn)組樣片做同樣處理后，同放一平板內(nèi)，用半固體瓊脂覆蓋培養(yǎng)，作為陽(yáng)性對(duì)照。
（7）試驗(yàn)同時(shí)，試驗(yàn)菌懸液作活菌計(jì)數(shù)，并觀察不含抗（抑）菌劑的對(duì)照樣片受試菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)。
（8）試驗(yàn)重復(fù)3次。
（9）按下列公式計(jì)算抑菌率。
2.1.8.9.4 評(píng)價(jià)規(guī)定
陽(yáng)性對(duì)照生長(zhǎng)菌數(shù)≥100cfu/片，抑菌率≥99.00%，可判為有抑菌作用。
2.1.8.9.5 注意事項(xiàng)
（1）樣片滴染菌懸液時(shí)，勿溢出片外。
（2）覆蓋用瓊脂的溫度以在45℃～50℃間為宜，不可過(guò)熱。
