土壤生物和生物化學(xué)性質(zhì)分析  

 

8.1采樣與樣品預(yù)處理                                            

土壤樣品的采集方法和要求與測(cè)定其它土壤性質(zhì)時(shí)沒(méi)有本質(zhì)區(qū)別。采集到的新鮮土壤樣品立即去除植物殘?bào)w、根系和可見(jiàn)的土壤動(dòng)物（如蚯蚓）等，然后迅速過(guò)篩（2～3mm），或放在低溫下（2～4oC）保存，如果土壤太濕無(wú)法過(guò)篩，進(jìn)行晾干時(shí)必須經(jīng)常翻動(dòng)土壤，避免局部風(fēng)干導(dǎo)致微生物死亡。過(guò)篩的土壤樣品調(diào)節(jié)到40％左右的田間持水量，在室溫下放在密閉的裝置中預(yù)培養(yǎng)1周，密閉容器中要放人兩個(gè)適中的燒杯，分別加入水和稀NaOH浴液，以保持其濕度和吸收釋放的CO₂。預(yù)培養(yǎng)后的土壤*好立即分析，也可放在低溫下（2～4oC）保存。

 

8.2土壤微生物生物量的測(cè)定  

 

土壤微生物生物量是指土壤中體積小于5～10μm³活的微生物總量，是土壤有機(jī)質(zhì)中*活躍的和*易變化的部分。耕地表層土壤中，微生物生物量碳（Bc）一般占土壤有機(jī)碳總量的3％左右。土壤微生物生物量與土壤中的C、N、P、S等養(yǎng)分的循環(huán)密切相關(guān)，其變化可直接或間接地反映土壤耕作制度和土壤肥力的變化，并可以反映土壤污染的程度。由于土壤微生物的多樣性和復(fù)雜性，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、適應(yīng)性廣的方法。目前廣泛應(yīng)用的方法包括：氯仿熏蒸培養(yǎng)法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基質(zhì)誘導(dǎo)呼吸法（SIR）、精氨酸誘導(dǎo)氨化法和三磷酸腺昔（ATP）法。每種方法都有其優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)和適用范圍及條件，一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備和條件，以及研究的目的，選擇測(cè)定土壤微生物生物量的方法。

 

 

 

方法原理該方法是基于以下5個(gè)假設(shè)：①被殺死的微生物生物量中的碳較活體中的碳能更快地被分解；②熏蒸**處理很完全；③沒(méi)有熏蒸**的土壤，在培養(yǎng)期間微生物死亡極少，可以忽略不計(jì)；④被熏蒸殺死的微生物，在培養(yǎng)期間被分解的比例，所有土壤都一樣，即所有的土壤可以用一個(gè)共同的轉(zhuǎn)換系數(shù)Kc值；⑤熏蒸**處理對(duì)土壤物理和化學(xué)性質(zhì)沒(méi)有任何影響。

 

實(shí)際上，完全符合這5個(gè)假設(shè)是不可能的。目前所用的方法是基于土壤經(jīng)氯仿熏蒸處理后，再進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，有大量的CO₂釋放出來(lái)。所釋放CO₂是來(lái)源于被氯仿熏蒸殺死的微生物。以不熏蒸土壤在培養(yǎng)期間所釋放的CO₂量做為空白，根據(jù)二者之間的差值來(lái)計(jì)算土壤微生物生物量碳。該方法*大的困難是空白的選擇，目前還沒(méi)有統(tǒng)一的看法。該方法不適用于pH＜4.5的酸性土壤，也不能用于含有大量易分解有機(jī)物的土壤，用于漬水土壤和石灰性土壤時(shí)也要慎重。

 

結(jié)果計(jì)算

 

1. CO₂-C的釋放量（Fc）mg kg^-1=（V1-V2）*C*M*1000*k/m

式中：

V1：土樣處理滴定時(shí)所消耗的鹽酸體積，mL；V2：無(wú)土空白對(duì)照滴定時(shí)所消耗的鹽酸體積，mL；C：鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，molL^-1；M：碳的毫摩爾質(zhì)量，12mgmmo1^-1；1000：轉(zhuǎn)換為kg的系數(shù)；k：分取偌數(shù)；m：土壤樣品的烘于質(zhì)量，g。

 

2. 微生物生物量碳（Bc）mg kg^-1 = Fc/Kc

 

式中：

Fc：0～10天培養(yǎng)期間熏蒸土壤釋放的CO₂-C量與未熏蒸土樣培養(yǎng)期間釋放的CO₂-C量的差值，mgkg^-1，Kc：培養(yǎng)期間被殺死的微生物礦化成CO₂-C的比例，常取0.45。

 

3. 微生物生物量氮（B_N）mg kg^-1 =F_N/K_N

 

式中：

F_N：[（熏蒸土樣中NO₃^--N +NH₄⁺-N）] -[（未熏蒸土樣中NO₃^--N +NH₄⁺-N）]，mgkg^-1；K_N為培養(yǎng)期間被殺死的微生物量中的氮轉(zhuǎn)化為NO₃^--N和 NH₄⁺-N的比例，一般為0.57。

 

8.3土壤呼吸作用的測(cè)定

 

土壤呼吸作用一詞有各種不同的含義，但一般系指土壤中活的，有代謝作用的實(shí)體，在代謝過(guò)程中吸收氧和釋放CO₂的強(qiáng)度。

 

土壤呼吸來(lái)源于生物和非生物兩個(gè)方面。生物來(lái)源包括土壤微生物的呼吸，植物根系的呼吸和原生動(dòng)物的呼吸。非生物來(lái)源主要是化學(xué)的氧化過(guò)程。在這些來(lái)源中，土壤微生物的呼吸是主要的。它通過(guò)呼吸（O₂的吸收和CO₂的釋放）來(lái)表現(xiàn)它的代謝過(guò)程，反映生態(tài)系統(tǒng)中能流、物流的動(dòng)態(tài)過(guò)程及方向。土壤中的**、**、藻類和原生動(dòng)物的細(xì)胞，對(duì)O₂的吸收或CO₂的釋放，也包括由好氣和嫌氣代謝所產(chǎn)生的氣體交換，因此，又稱為微生物呼吸作用。

 

土壤呼吸作用強(qiáng)度能反映土壤中有機(jī)質(zhì)的分解，以及土壤有效養(yǎng)分的狀況，因此，很早以來(lái)就被人們利用它作為土壤微生物總的活性指標(biāo)或作為評(píng)價(jià)土壤肥力的尺度之一。無(wú)疑，測(cè)定土壤呼吸作用對(duì)研究土壤中的生物化學(xué)反應(yīng)和土壤有機(jī)質(zhì)的分解速率均有重要意義。

 

測(cè)定土壤呼吸作用的方法很多，都是以測(cè)定其過(guò)程中O₂的吸收值和CO₂釋放量為內(nèi)容，據(jù)此，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了各種測(cè)定裝置，既有簡(jiǎn)單可行的野外測(cè)定方法，也有靈敏可靠的儀器分析方法，如滴定法、容量法、比色法、重量法、比濁法、電導(dǎo)法、儀器分析法、紅外吸收光譜、氣相色譜、質(zhì)譜分析、測(cè)壓法和氣體分析法等，這些方法各有特點(diǎn)，但尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)方法。大多測(cè)定土壤中CO₂的釋放量。

 

 

方法原理利用一定濃度的NaOH溶液吸收土壤呼吸所釋放出的CO₂，然后用標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定剩余的NaOH量，根據(jù)NaOH溶液的消耗量，計(jì)算出CO₂的釋放量。

 

結(jié)果計(jì)算

 

CO₂（mg kg-1）={[(V0-V)*C*0.022*（22.4/44）*1000]*2*1000}/m

 

式中：

V0：空白滴定時(shí)消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，mL；V：樣品滴定時(shí)消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，mL；C：標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的濃度，molL^-1；0.022：CO₂的毫摩爾質(zhì)量，gmmol^-1；22.4*1000/44：標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下每克CO₂的毫升數(shù)。

 

注意事項(xiàng)

1. 培養(yǎng)前，試驗(yàn)用的培養(yǎng)瓶要經(jīng)過(guò)認(rèn)真挑選，確保培養(yǎng)瓶與內(nèi)外蓋緊密配套。

2.粘粒含量高的土壤（如第四紀(jì)紅粘土），培養(yǎng)時(shí)調(diào)節(jié)水分一般不要超過(guò)該土壤*大持水量的40％。水分太高，CO₂釋放受阻，從而導(dǎo)致土壤呼吸強(qiáng)度減弱。

3.為確保培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)瓶不漏氣，*好在蓋內(nèi)蓋之前，先加蒙一層塑料膠帶，以防CO₂損失，結(jié)果偏低。

 

8.4土壤酶活性的測(cè)定

 

土壤中養(yǎng)分的循環(huán)過(guò)程涉及到各種生物化學(xué)、化學(xué)和物理化學(xué)反應(yīng)。其中，生物化學(xué)過(guò)程是由酶的催化作用完成的。這種由酶參與的生物化學(xué)反應(yīng)可以發(fā)生在植物根系和土壤生物的細(xì)胞內(nèi)（包括細(xì)胞膜和細(xì)胞壁上），是生命代謝活動(dòng)的一部分。而發(fā)生在細(xì)胞外土壤介質(zhì)中的生物化學(xué)反應(yīng)，則是由土壤酶來(lái)完成的，土壤酶來(lái)源于植物、動(dòng)物和微生物，在土壤中主要參與各種有機(jī)物質(zhì)的分解、合成與轉(zhuǎn)化，以及無(wú)機(jī)物質(zhì)的氧化與還原等過(guò)程。土壤酶以游離形態(tài)存在的數(shù)量很少，絕大多數(shù)土壤酶與土壤有機(jī)和無(wú)機(jī)固相物質(zhì)相結(jié)合，形成酶-有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合體。

 

土壤酶活性是土壤肥力的一個(gè)重要指標(biāo)，它在很大程度土反映了土壤中物質(zhì)循環(huán)與轉(zhuǎn)化的強(qiáng)度。土壤酶活性一般用單位重量的土壤在單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物的生成量或底物的減少量來(lái)表征。然而，由于測(cè)定條件和方法的限制，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行解釋時(shí)應(yīng)小心。這主要是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室的測(cè)定是在*適培養(yǎng)條件下進(jìn)行的，難以反映出土壤酶在田間實(shí)際條件下的活性。此外，現(xiàn)行的抑制生物活性的方法難以做到既能有效地抑制土壤生物的話性，又能防止胞內(nèi)酶的釋放，因此，測(cè)定的土壤酶活性可能包括了來(lái)自土壤生物作用部分的結(jié)果。

 

方法原理土壤酶催化的土壤生物化學(xué)反應(yīng)與生物體內(nèi)的酶促反應(yīng)一樣，具有專一性以及對(duì)底物較強(qiáng)的親合能力。在進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，土壤酶首先與底物形成復(fù)合體，這種復(fù)合體是不穩(wěn)定的，經(jīng)過(guò)一步或者數(shù)步的重新組合，釋放出酶和產(chǎn)物。某一特定土壤酶的活性可通過(guò)測(cè)定由該酶催化的化學(xué)反應(yīng)速率來(lái)表征，測(cè)定的結(jié)果以單位重量的土壤在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量或者底物的減少量來(lái)表示。

 

影響酶舌性的因素

 

1. 酶和底物的濃度土壤酶的活性取決于酶和底物的濃度。對(duì)給定的時(shí)間和樣品，土壤酶的濃度可以認(rèn)為是一個(gè)常數(shù)。此時(shí)，大多數(shù)土壤酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)符合零級(jí)或**化學(xué)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，與底物的濃度有關(guān)。這些反應(yīng)可用酶動(dòng)力學(xué)方程式（米氏方程式）來(lái)描述。

2. 溫度 任何化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率均隨著溫度的升高而增加，大約每升高10℃，反應(yīng)速率增加1倍。酶在高溫下容易失活，因此當(dāng)溫度升高到一定時(shí)，反應(yīng)速率下降。大多數(shù)土壤酶在60～70℃變性，有些土壤酶發(fā)生變性的溫度較低。土壤酶的穩(wěn)定性隨著溫度的降低而增加。

3．pH氫離子濃度影響土壤酶、底物等的離子化程度和溶解度，從而影響酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和與底物的親合能力。任何酶都在一個(gè)特定pH（*適pH）時(shí)活性*大，高于或低于該值，酶的活性均下降。因此測(cè)定土壤酶活性常常是在緩沖溶液中進(jìn)行。

4. 其他因素許多酶只有在與非蛋白質(zhì)物質(zhì)結(jié)合時(shí)才表現(xiàn)出活性，這些非蛋白質(zhì)因子包括輔基、輔酶。此外，有些酶還需要金屬離子來(lái)激活。許多種化學(xué)物質(zhì)能夠抑制土壤酶的活性。酶抑制劑的種類很多，有些抑制劑與酶的作用部位結(jié)合，有的與酶激活劑和輔酶結(jié)合，抑制酶的活性。其抑制作用有可逆的，也有導(dǎo)致酶完全失活的不可逆反應(yīng)。在可逆性抑制作用中，有競(jìng)爭(zhēng)性抑制，也有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。而且，產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生反饋抑制作用。

 

8.4.1脲酶活性的測(cè)定

 

脲酶是酰胺水解酶的一種，在自然界中分布廣泛，植物、動(dòng)物和微生物細(xì)胞中均含有此酶。土壤中的脲酶主要來(lái)源于微生物和植物。脲酶催化尿素的水解反應(yīng)：

 

H₂NCONH₂ + H2O →2NH₃ + CO₂

 

在反應(yīng)過(guò)程中，氨基甲酸鹽是中間產(chǎn)物。脲酶還能夠催化羥基脲、二羥基脲、半卡巴脲等化合物的水解。脲酶含有鎳，分子量在151，000～480，000Da之間。能夠抑制脲酶活性的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50的重金屬的鹽、含氟化合物、醌和多元酚、抗代謝劑、雜環(huán)硫醇等。

 

方法原理 通過(guò)對(duì)新鮮土壤與尿素溶液在37oC培養(yǎng)2h后測(cè)定氨釋放量，估計(jì)脲酶的活性。

 

結(jié)果計(jì)算

 

脲酶的活性（單位時(shí)間內(nèi)銨態(tài)氮的釋放量，N mg kg^-1h^-1） = C*V*k*14/（m*K*2）*1000

 

式中：

C：標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol L^-1；V：標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；k：分取系數(shù)；14：氮的摩爾質(zhì)量，mgmmol^-1； K：水分系數(shù)；2：培養(yǎng)時(shí)間，2 h；m：樣品質(zhì)量，g。

 

注意事項(xiàng)

 

與其他緩沖液（如磷酸鹽綏沖液）相比，三（羥甲基）氨基甲烷緩沖液優(yōu)點(diǎn)在于它能夠有效地防止銨的固定。在配制該緩沖液時(shí)必須用硫酸而不是鹽酸來(lái)調(diào)pH，因?yàn)楹笳吣軌虼龠M(jìn)脲酶的活性。

 

8.4.2磷酸單酯酶活性的測(cè)定

 

磷酸酶是土壤中廣泛存在的一種水解酶，能夠催化磷酸酯的水解反應(yīng)，包括磷酸單酯酶、磷酸二酯酶、三磷酸單酯酶等。其中，磷酸單酯酶由于與有機(jī)磷的礦化及植物的磷素營(yíng)養(yǎng)關(guān)系密切，因此是研究*多的磷酸酶。磷酸單酯酶又基于其反應(yīng)的*適pH值，分為酸性（pH5～6）和堿性磷酸酶（pH8～10）。磷酸單酯酶能夠催化?-甘油磷酸酯、苯磷酸酯、?-萘磷酸酯、硝基苯磷酸酯等的水解。磷酸根的存在對(duì)磷酸單酯酶的活性有競(jìng)爭(zhēng)抑制作用。此外，重金屬和微量元素也抑制磷酸單酯酶的活性。測(cè)定磷酸單酯酶活性的方法有很多，這些方法的區(qū)別主要體現(xiàn)在所用的底物不同，以及由此產(chǎn)生的測(cè)定水解產(chǎn)物的方法各異。目前常用的是用對(duì)硝基苯磷酸脂法測(cè)定磷酸單酯酶的活性，用雙對(duì)硝基苯磷酸脂法測(cè)定磷酸二酯酶的活性。

 

 

方法原理測(cè)定磷酸單酯酶是基于該酶能夠水解對(duì)硝基苯磷酸鹽，通過(guò)比色法測(cè)定反應(yīng)后釋放的對(duì)硝基苯酚的含量，來(lái)估計(jì)磷酸單酯酶的活性。酸性和堿性磷酸酶的活性可通過(guò)控制反應(yīng)的pH值來(lái)分別測(cè)定。測(cè)定酸性磷酸酶活性時(shí)，溶液的pH為6.5，堿性磷酸酶的pH為11。

 

結(jié)果計(jì)算

 

磷酸單酯酶活性（單位時(shí)間內(nèi)對(duì)硝基苯酚的產(chǎn)生量，C₆H₅NO₃ mgkg^-1 h^-1）= m1/（m2*K）*1000

 

式中：

m1：測(cè)試溶液中對(duì)硝基苯酚的質(zhì)量，mg；m2：樣品質(zhì)量，g；K：水分系數(shù)。

 

注意事項(xiàng)

 

為消除土壤浸出液顏色的影響，應(yīng)做對(duì)照。

 

8.4.3磷酸二脂酶活性的測(cè)定

 

 

方法原理 通過(guò)用比色法測(cè)定磷酸二酯酶水解雙p-硝基苯磷酸脂反應(yīng)后釋放的對(duì)硝基苯酚的量，來(lái)估計(jì)其活性。

 

結(jié)果計(jì)算

 

同對(duì)硝基苯磷酸鹽法。

 

注意事項(xiàng)

 

為消除土壤浸出液顏色的影響，應(yīng)做對(duì)照。