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薄層層析法黃曲霉**B1的測(cè)定
日期：2025-02-08 11:07
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摘要：
薄層層析法黃曲霉**B1的測(cè)定
一、原理
樣品中AFTB1經(jīng)有機(jī)溶劑提取、凈化、濃縮并經(jīng)薄層色譜分離后，在波長(zhǎng)365nm紫外光下產(chǎn)生熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)品AFTB1*低檢出量產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比較來測(cè)定樣品中AFT B1的含量。
二、試劑
三氯甲烷（AR）
正己烷（AR沸程30-60）或石油醚（沸程60-90）
甲醇（AR）
苯 （AR）
乙腈 （AR）
無水乙醚（AR）
丙酮 （AR）
（以上試劑應(yīng)重蒸，并應(yīng)經(jīng)檢驗(yàn)對(duì)薄層色譜測(cè)定無干擾）
苯-乙腈(98:2)混合溶液
甲醇-水（55:45）混合溶液
三氟乙酸（AR）
氯化鈉（AR）
無水硫酸鈉（AR）
硅膠G（薄層色譜用）
5%次氯酸鈉溶液：稱取100g漂白精，加入500mL水，攪勻。另將80g工業(yè)用碳酸鈉（Na2CO3.10H2O）溶于500mL溫水中，倒入上述溶液中，攪勻，澄清過濾后貯存于帶橡皮塞的玻璃瓶中，用作**劑。
黃曲霉**B1標(biāo)準(zhǔn)貯備液：用百萬分之一的微量分析天平精密稱取1-1.2mgAFTB1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光置于4℃冰箱中保存。使用前用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，再用苯-乙腈混合溶液調(diào)整其濃度為10ug/mL。（在350nm測(cè)定AFTB1的苯-乙腈溶液的吸光度，其摩爾消光系數(shù)為19800，可根據(jù)朗伯-比爾定律求出其濃度）。
黃曲霉**B1標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液I（1ug/mL）：吸取1.0mL10ug/mL的黃曲霉**B1標(biāo)準(zhǔn)貯備液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。
黃曲霉**B1標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液II（0.2ug/mL）：吸取1.0mL1ug/mL的黃曲霉**B1標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液I于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。
黃曲霉**B1標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液III(0.04ug/mL)：吸取1.0mL0.2ug/mL的黃曲霉**B1標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液II于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液定容。
三、主要儀器
玻璃板：5×20cm
涂布器
色譜展開槽（25×6×4cm）
紫外光燈：100-125W，帶有波長(zhǎng)365nm濾光片
微量注射器：20uL,10uL各一支
四、操作步驟
1、樣品預(yù)處理
稱取4g混勻的花生油樣品于小燒杯中，用20mL石油醚或正己烷，將其轉(zhuǎn)移到125mL分液漏斗中，用20mL甲醇-水溶液分?jǐn)?shù)次洗燒杯，洗液并入分液漏斗中，振搖2分鐘，靜止分層后，將下層甲醇-水溶液移入**分液漏斗，再用5mL甲醇-水溶液重復(fù)提取一次，提取液并入**分液漏斗中。在**分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，振搖2分鐘，靜止分層后，放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10g先用三氯甲烷濕潤(rùn)的無水硫酸鈉的慢速濾紙過濾于50mL蒸發(fā)皿中，分液漏斗中再加5mL三氯甲烷提取一次，三氯甲烷層一并濾入蒸發(fā)皿中，*后用少量三氯甲烷洗過濾器，洗液并入蒸發(fā)皿中。在通風(fēng)柜中，將蒸發(fā)皿于65℃水浴上揮干，然后放入冰盒上泠卻2-3分鐘，準(zhǔn)確加入1mL苯-乙腈混合液，用帶橡皮頭滴管的管尖將殘?jiān)浞只旌?，若有結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿取下，繼續(xù)溶解、混勻，晶體消失后用滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL具塞試管中。
2、樣品測(cè)定
1>薄層板的制備
稱取約3g硅膠G，加相當(dāng)于硅膠量的2-3倍左右的水，用力研磨1-2分鐘，至成糊狀后立即倒入涂布器內(nèi)，推鋪成5×20cm、厚度為0.25mm的薄層板三塊。于空氣中干燥約15分鐘后，在100℃下活化2小時(shí)，取出放入干燥器中保存。
2>點(diǎn)樣
將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板底端3cm的基線上用微量注射器滴加樣液和標(biāo)準(zhǔn)液：
**點(diǎn)：10uL 0.04ug/mLAFT B1 標(biāo)液
**點(diǎn)：20uL樣液
第三點(diǎn)：20uL 樣液 + 10uL0.04ug/mL AFT B1 標(biāo)液
第四點(diǎn)：20uL 樣液 + 10uL0.2ug/mL AFT B1 標(biāo)液
要求點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距約為1cm,樣點(diǎn)直徑約3cm,大小相同，點(diǎn)樣時(shí)可用電吹風(fēng)冷風(fēng)邊吹邊點(diǎn)。
3>展開
在展開槽內(nèi)加10mL無水乙醚，將點(diǎn)好樣的薄層板預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加10mL丙酮+三氯甲烷（8+92）混合溶劑，展開10-12cm，取出揮干。
4>結(jié)果觀察
將展開好的薄板放在365nm的紫外燈光下觀察：a.若**點(diǎn)無熒光或都無熒光。說明薄板或展開劑未制備好，需重新制備。b.**點(diǎn)有熒光，而其余三點(diǎn)無熒光。說明樣液中有熒光猝滅劑，樣液需重新制備。c.**點(diǎn)有熒光，**點(diǎn)無熒光，三、四點(diǎn)有熒光。說明樣液不含AFT B1或含量小于*低檢出量。d.四個(gè)點(diǎn)都有熒光。需做確證實(shí)驗(yàn)后再進(jìn)行定量。
5>確證實(shí)驗(yàn)
于另一薄板上左邊依次點(diǎn)二個(gè)樣：
**點(diǎn)：10uL0.04ug/mL AFTB1標(biāo)液
**點(diǎn)：20uL樣液
在以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸（TFA），待反應(yīng)5分鐘后，用電吹風(fēng)熱風(fēng)2分鐘，使溫度不高于40℃。
再于薄層板的右邊點(diǎn)以下二個(gè)點(diǎn)：
第三點(diǎn)：10uL 0.04ug/L AFTB1 標(biāo)液
第四點(diǎn)：20uL樣液
同第3>步展開后，于紫外光下觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物AFT B2a,未加TFA的第三、四點(diǎn)作空白對(duì)照。
6>稀釋定量
若**點(diǎn)的熒光強(qiáng)度比**點(diǎn)強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)減少點(diǎn)樣體積，于另一薄板上點(diǎn)四個(gè)點(diǎn)：
**點(diǎn)：10uL 0.04ug/mLAFT B1標(biāo)液
**點(diǎn)：10uL樣液
第三點(diǎn)：15uL樣液
第四點(diǎn)：20uL樣液
展開后取熒光強(qiáng)度與**點(diǎn)相同的樣點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算。
五、計(jì)算
X =
X ——樣品中AFT B1的含量ug/kg(ppb)
V1——稀釋前樣液的總體積mL
V2——出現(xiàn)同等熒光強(qiáng)度的稀釋后樣液點(diǎn)樣量uL
D ——樣液的稀釋倍數(shù)
