紫外分光光度法測定魚肝油中維生素A的含量

一、原理

維生素A的異丙醇溶液在325nm波長處有*大吸收峰，其吸光度與維生素A的含量成正比。

二、試劑

維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液：視黃醇85%（或視黃醇乙酸脂90%）經(jīng)皂化處理后使用。稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用脫醛乙醇溶解使其濃度大約為1mg/mL。臨用前需進(jìn)行標(biāo)定。取標(biāo)定后的維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成10 I.U/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

標(biāo)定：取維生素A溶液若干微升，用脫醛乙醇稀釋3.00Ml，在325nm處測定吸光度，用此吸光度計(jì)算出維生素A的濃度。

    C——維生素A的濃度g/mL

    A——維生素A的平均吸光度值

    S——加入的維生素A溶液量μL

    E——1%維生素A的比吸光系數(shù)：

無水脫醛乙醇：取2g硝酸銀溶入少量水中。取4g氫氧化鈉溶于溫乙醇中。將兩者傾入盛有1L乙醇的試劑瓶中，振搖后，暗處放置兩天（不時(shí)搖動(dòng)促進(jìn)反應(yīng)）。取上層清液蒸餾，棄去初餾液50mL。

酚酞：用95%乙醇配制成1%的溶液。

1:1氫氧化鉀；0.5mol/L 氫氧化鉀；無水乙醚：不含過氧化物；異丙醇

三、操作步驟

1、樣品處理

皂化：稱取0.5-5g充分混勻的魚肝油于三角瓶中，加入10mL1:1氫氧化鉀及20-40mL乙醇，在電熱板上回流30分鐘。加入10mL水，稍稍振搖，若有混濁現(xiàn)象，表示皂化完全。

提?。簩⒃砘阂迫敕忠郝┒?，先用30mL水分兩次洗滌皂化瓶（若有渣，可用經(jīng)過脫脂棉過濾），再用50mL乙醚分兩次洗滌皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振搖兩分鐘（注意放氣），靜止分層后，水層放入**分液漏斗。皂化瓶再用30mL乙醚分兩次洗滌，洗液倒入**分液漏斗，振搖后靜止分層，將水層放入第三分液漏斗，醚層并入**分液漏斗。重復(fù)操作3次。

洗滌：向**分液漏斗的醚液中加入30mL水，輕輕振搖，靜止分層后放出水層。再加15-20mL0.5mol/L的氫氧化鉀溶液，輕輕振搖，靜止分層后放出堿液。再用水同樣操作至洗液不使酚酞變紅為止。醚液靜止10-20分鐘后，小心放掉析出的水。

濃縮：將醚液經(jīng)過無水硫酸鈉濾入三角瓶中，再用約25mL乙醚洗滌分液漏斗和硫酸鈉兩次，洗液并入三角瓶中。用水浴蒸餾回收乙醚，待瓶中剩余約5mL乙醚時(shí)取下減壓抽干，立即用異丙醇溶解并移入50mL容量瓶中用異丙醇定容。

2、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取維生素A標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00mL于10mL容量瓶中用異丙醇定容。以零管調(diào)零，于紫外分光光度計(jì)上在325nm處分別測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、樣品測定

取濃縮后的定容液于紫外分光光度計(jì)上在325nm處測定吸光度，通過此吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出維生素A的含量。

四、計(jì)算                   

維生素A（I.U/100g）=                         

C——測出的樣品濃縮后的定容液的維生素A的含量I.U/mL

V——濃縮后的定容液的體積mL

m——樣品的質(zhì)量g